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CUT&RUN

クロマチンにおけるタンパク質-DNA相互作用を解析するChIP-qPCRおよびChIP-seqを少ない細胞数で代わるCUT&RUNについて学ぶ 

概要

クロマチン免疫沈降 (ChIP) やChIP-seqといったタンパク質とDNAの相互作用をマッピングする技術が開発されたことで、エピジェネティックな制御の異常が様々な疾患の原因となることが分かってきました。CUT&RUN (Cleavage Under Target & Release Using Nuclease) は、タンパク質とDNAの相互作用を解析する新技術です。

原理

CUT&RUNはin vivoにて、標的に特異的な一次抗体とProtein A-Protein G-Micrococcal Nuclease (pAG-MNase) を用いて、特定のタンパク質-DNA複合体を分離します1,2,3。この手法によって細胞から目的のDNAをわずか1-2日で回収することができ、自動化してスループットと再現性を最大限に高めることも可能です4

CUT&RUN概略図

目的のタンパク質とDNAの複合体を得るため、はじめに細胞をコンカナバリンAでコーティングした磁気ビーズに結合させます。これによって細胞の取り扱いを簡便化し、後の洗浄操作での脱落を最小限に抑えます。細胞膜をジギトニンで透過化処理して一次抗体の核への進入を促進し、目的のヒストン、転写因子あるいはコファクターに結合させます。次に、pAG-MNase融合タンパク質のpAGドメインが一次抗体の重鎖に結合し、目的のクロマチン領域に酵素を配置します。Ca2+を加えることでpAG-MNaseが活性化され、DNAの消化が起こります。これによって切り出されたクロマチン複合体はゲノムクロマチンから解離して核外に拡散します。こうしてサンプルの上清に拡散したDNAをスピンカラム、あるいはフェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿で回収します。

精製、濃縮されたDNAはqPCRによる同定や定量、あるいはライブラリーを構築して次世代シーケンサー (NGS) による全ゲノム解析に用いることができます。

CUT&RUNの利点

Cell Signaling Technology® (CST) は、ほかの全ゲノムマッピング技術が持つ多くの課題を克服するCUT&RUN キットを提供します。CST CUT&RUNキットには次のような利点があります:

微量サンプルの解析が可能 必要な細胞数はわずか10万です
短時間でデータを取得可能 わずか1-2日で細胞から目的のDNAが得られます
シーケンシングコストの低減 必要な高品質リードの数はわずか300-500万です
多様な標的に対応 ヒストンやヒストン修飾、転写因子、コファクターのqPCRデータやシーケンシングデータが得られます
多様な抗体に対応 ラビット抗体およびマウス抗体をご利用いただけます
再現性の高い結果 Spike-In DNAを利用してサンプル間のシグナルを標準化することができます
「クロスリンクアーティファクト」の回避 未変性のクロマチンを用いたin vivoの解析法です

 

微量サンプルの解析が可能

10万個の細胞からタンパク質-DNA相互作用の解析が可能なので、培養の時間を節約することができ、存在量の少ない細胞からもエピジェネティックな情報を得ることができます。

細胞数を漸減した場合のCUT&RUNの結果

CUT&RUN Assay Kit #86652を用いてCUT&RUNを実施したところ、サンプルであるHCT116細胞の数を徐々に減らしても同様の結果が得られました。左のパネルにはTri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751を用いた解析の結果、右のパネルにはPhospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb #13499を用いた解析の結果を示しました。SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989を用いて濃縮したDNAをリアルタイムPCRで解析しました。PCRに用いたプライマーセットはそれぞれ、SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516SimpleChIP® Human β-Actin Promoter Primers #13653SimpleChIP® Human β-Actin 3' UTR Primers #13669SimpleChIP® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490です。CUT&RUNで回収されたDNA量を、Inputクロマチンに対する相対量 (100,000細胞の総クロマチン量を100%とした相対値) で示しました。それぞれの反応系に加えたSpike-In DNAでデータを標準化しました。

短時間でデータを取得可能

標的クロマチンを濃縮する時間を節約できます。わずか1-2日で細胞から目的のDNAが得られます。

シーケンシングコストの低減

バックグラウンドが低いので、低深度のシーケンシングでもゲノムのバックグラウンドノイズとシグナルを区別できます。シーケンシングデータを得るのに必要な高品質リードの数はわずか300-500万で、シーケンシングコストが大幅に低減されます。また、バックグラウンドが低いので、シグナルの弱いゲノム特性のプロファイルを作成することも可能です。

多様な標的に対応

精製、濃縮されたDNAをシーケンシングやqPCRに用いて、ヒストン修飾や転写因子、コファクターを解析できます。

ヒストン修飾

ヒストン修飾の解析において、CUT&RUN Assay Kit #86652はChIP-qPCRおよびChIP-seqと同等に機能し、わずか100,000細胞からデータが得られます。

CUT&RUNおよびChIPによるH3K4me3のqPCRの結果

CUT&RUN Assay Kit #86652あるいはSimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005を用いて、CUT&RUN (左のパネル) およびChIPアッセイ (右のパネル) を実施しました。それぞれTri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751あるいはRabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362を用いて、HCT116細胞 (CUT&RUNは1x105細胞、ChIPは4x106細胞を使用) を解析しました。SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989を用いて濃縮したDNAをリアルタイムPCRで定量しました。PCRに用いたプライマーセットはそれぞれ、SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486です。各サンプルで回収されたDNA量を、インプットクロマチンの総量 (1に相当) に対する相対量で示しました。

CUT&RUNおよびChIPによるH3K4me3のシーケンシングの結果

CUT&RUN Assay Kit #86652あるいはSimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005を用いて、CUT&RUNおよびChIPアッセイを実施しました。Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751を用いて、HCT 116細胞 (CUT&RUNは1x105細胞、ChIPは4x106細胞を使用) を解析しました。DNAライブラリーはSimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795を用いて調製しました。12番染色体の広域に渡る濃縮の比較をパネルA、H3K4me3修飾されることが知られるGAPDH遺伝子の濃縮の比較をパネルBに示しました。InputトラックにはCUT&RUNのInputサンプルから得られたデータを示しました。

転写因子

転写因子のDNA-タンパク質相互作用の解析において、CUT&RUN Assay Kit #86652はChIP-qPCRやChIP-seqと同等に機能し、わずか100,000細胞からデータが得られます。

CUT&RUNおよびChIPによるCTCFのqPCRの結果

CUT&RUN Assay Kit #86652あるいはSimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005を用いて、CUT&RUN (左のパネル) およびChIPアッセイ (右のパネル) を実施しました。それぞれCTCF (D31H2) XP® Rabbit mAb #3418あるいはRabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362を用いて、HCT116細胞 (CUT&RUNは1x105細胞、ChIPは4x106細胞を使用) を解析しました。SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989を用いて濃縮したDNAをリアルタイムPCRで定量しました。PCRに用いたプライマーセットはそれぞれ、ヒトc-Mycプロモータープライマー、SimpleChIP® Human H19/Igf2 ICR Primers #5172SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486です。各サンプルで回収されたDNA量を、インプットクロマチンの総量 (1に相当) に対する相対量で示しました。

CUT&RUNおよびChIPによるCTCFのシーケンシングの結果

CUT&RUN Assay Kit #86652あるいはSimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005を用いて、CUT&RUNおよびChIPアッセイを実施しました。CTCF (D31H2) XP® Rabbit mAb #3418を用いて、HCT116細胞 (CUT&RUNは1x105細胞、ChIPは4x106細胞を使用) を解析しました。DNAライブラリーはSimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795を用いて調製しました。8番染色体の広域に渡る濃縮の比較をパネルA、CTCFの既知の標的であるMYC遺伝子の濃縮の比較をパネルBに示しました。InputトラックにはCUT&RUNのInputサンプルから得られたデータを示しました。

コファクター

コファクターのDNA-タンパク質相互作用の解析において、CUT&RUN Assay Kit #86652はChIP-qPCRやChIP-seqと同等に機能し、わずか100,000細胞からデータが得られます。

CUT&RUNおよびChIPによるRpb1のCTDのqPCRの結果

CUT&RUN Assay Kit #86652あるいはSimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005を用いて、CUT&RUN (左のパネル) およびChIPアッセイ (右のパネル) を実施しました。それぞれRpb1 CTD (4H8) Mouse mAb #2629あるいはRabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362を用いて、HeLa細胞 (CUT&RUNは1x105細胞、ChIPは4x106細胞を使用) を解析しました。SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989を用いて濃縮したDNAをリアルタイムPCRで定量しました。PCRに用いたプライマーセットはそれぞれ、SimpleChIP® Human RPL30 Exon 3 Primers #7014SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516SimpleChIP® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490です。各サンプルで回収されたDNA量を、インプットクロマチンの総量 (1に相当) に対する相対量で示しました。

CUT&RUNおよびChIPによるRpb1のCTDのシーケンシングの結果

CUT&RUN Assay Kit #86652を用いて、CUT&RUNおよびChIPアッセイを実施しました。Rpb1 CTD (4H8) Mouse mAb #2629を用いて、HeLa細胞 (CUT&RUNは1x105細胞、ChIPは4x106 細胞を使用) を解析しました。DNAライブラリーはSimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795を用いて調製しました。12番染色体の広域に渡る濃縮の比較をパネルA、Rpb1の既知の標的であるGAPDH遺伝子の濃縮の比較をパネルBに示しました。InputトラックにはCUT&RUNのInputサンプルから得られたデータを示しました。

多様な抗体に対応

pAG-MNaseはマウス抗体とラビット抗体の両方に結合するので、非常に多くの抗体をCUT&RUNアッセイに用いることができます。

ラビット抗体

CUT&RUNはラビット抗体と適合性があります

CUT&RUN Assay Kit #86652を用いて、HeLa細胞をAcetyl-Histone H3 (Lys27) (D5E4) XP® Rabbit mAb #8173によるCUT&RUNで解析しました。DNAライブラリーはSimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795を用いて調製しました。12番染色体の広域に渡る濃縮の比較をパネルA、H3K27Ac修飾されることが知られるGAPDH遺伝子の濃縮の比較をパネルBに示しました。

マウス抗体

CUT&RUNはマウス抗体と適合性があります

CUT&RUN Assay Kit #86652を用いて、HeLa細胞をRpb1 CTD (4H8) Mouse mAb #2629によるCUT&RUNで解析しました。DNAライブラリーはSimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795を用いて調製しました。12番染色体の広域に渡る濃縮の比較をパネルA、Rpb1の既知の標的であるGAPDH遺伝子の濃縮の比較をパネルBに示しました。

高い再現性

異なる生物種のSpike-In DNAを用いてデータを標準化することで、実験の再現性が向上します。既定の実験や異なる実験のサンプル間で標準化ができます。

CUT&RUNアッセイのシグナルはSpike-In DNAで標準化できます

Spike-In DNAを用いて、qPCR解析でのCUT&RUNシグナルを標準化しました。CUT&RUN Assay Kit #86652を用いて、Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 (上のパネル) あるいはPhospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb #13499 (下のパネル) による、異なる細胞数のHCT 116細胞のCUT&RUNアッセイを実施しました。SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989を用いて濃縮したDNAをリアルタイムPCRで解析しました。PCRに用いたプライマーセットはそれぞれ、SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516SimpleChIP® Human β-Actin Promoter Primers #13653SimpleChIP® Human β-Actin 3' UTR Primers #13669SimpleChIP® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490です。CUT&RUNで回収されたDNA量を、Inputクロマチンに対する相対量 (100,000細胞の総クロマチン量を100%とした相対値) で示しました。標準化されていない濃縮を左のパネルに示します。各反応にSpike-In DNAを最初の細胞数に比例して加えました。各サンプルのSpike-In DNAからのqPCRシグナルに基づき、CUT&RUNシグナルを100,000細胞のサンプルに標準化しました。標準化した濃縮を右のパネルに示します。

「クロスリンクアーティファクト」の回避

CUT&RUNは未変性クロマチンに対して作用し、クロスリンクや免疫沈降を必要としないので「クロスリンクアーティファクト」が起こりません。

製品のご提供

CSTは、エピジェネティクス解析の初心者から専門家まで柔軟にご利用いただけるCUT&RUNアッセイ製品を提供しています。お客様ご自身で別途ご用意いただく必要があるのは、標的タンパク質に対する一次抗体のみです。そのほか必要なバッファーや試薬、詳細なプロトコールはすべて、CSTが簡単に注文できるCUT&RUN キットとして提供します。お客様の必要に応じて、pAG-MNaseとSpike-In DNAのみをご購入いただくこともできます。

CUT&RUNアッセイ製品は、CSTの他の製品と同様に社内で厳格に検証されていますので、お客様の実験に安心してご利用いただけます。

製品番号 製品
86652 CUT&RUN Assay Kit
40366 CUT&RUN pAG-MNase and Spike-in DNA
14209 DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN)
88989 SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix
56795 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina®
47538 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers)
29580 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers)
66362 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN)
93569 Concanavalin A Magnetic Beads and Activation Buffer
16359 Digitonin Solution
7012 Protease Inhibitor Cocktail (200X)
7013 RNAse A (10 mg/mL)
10012 Proteinase K (20 mg/mL)

参考文献

  1. Skene PJ, et al. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. (2018) Nat. Protoc 13(5), 1006-1019. Pubmed 29651053
  2. Meers MP, et al. Improved CUT&RUN chromatin profiling and analysis tools. (2019) BioRxiv 1, 569129. bioRxiv 569129
  3. Skene PJ, and Henikoff S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. (2017) Elife 6, e21865. Pubmed 28079019
  4. Janssens DH, et al. Automated in situ chromatin profiling efficiently resolves cell types and gene regulatory programs. (2018) Epigenetics Chromatin 22(1), 74. Pubmed 30577869
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