ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) で用いる試薬類

抗体

抗体の選択がELISAの結果に大きく影響します。したがって、捕捉や検出 (直接/間接) に用いる抗体について、以下のような検討を行う必要があります。

• 特異性：抗体は、単一抗原上の単一エピトープに結合する必要がある
• 親和性：迅速かつ強力な結合が必要である
• 結合力：一旦結合したら、抗体-抗原複合体は安定に保持される必要がある

 

マッチドペア

サンドイッチELISAには、同一抗原に結合する2種類の抗体 (補足抗体・検出抗体) が必要で、この組み合わせはよく「マッチドペア」と呼ばれます。それぞれの抗体は、同一標的 (抗原) の異なるエピトープに結合し、抗原を「サンドイッチ」するように複合体を形成します。2つの抗体を用いることで、アッセイの開発は困難になりますが、より特異性の高い結果が得られます。

CSTのELISAキットで使われている抗体のマッチドぺアは、それぞれの標的の捕捉、検出に最適な量を事前に検討し、最適化されています。CSTは、それぞれの抗体とキットで信頼性、再現性の高い結果が得られるように厳密な検証を実施しています。

捕捉抗体と検出抗体

ELISAではモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体ともに使用することが可能です。それぞれに異なる利点があるため、目的に応じて利用者が上手に使い分ける必要があります。

モノクローナル抗体は単一エピトープに特異的で、同一抗原の他の領域を認識する抗体の結合を阻害することはほとんどありません。他の抗原への非特異的に結合する可能性も低くなっています。したがって、モノクローナル抗体はELISAの全行程で使うことができ、特にサンドイッチELISAで、競合しない抗体のマッチドペアを選定する上で有用です。ほとんどのCSTのELISAキットは、モノクローナル抗体を使ってデザインされており、様々な研究トピックで信頼性、再現性の高い結果が得られます。

ポリクローナル抗体は、同一抗原の異なる領域に結合する抗体の集合です。モノクローナル抗体がより高い特異性を示すのに対し、ポリクローナル抗体は複数のエピトープに結合できることから、より強いなシグナルが得られる可能性があります。

ELISAバッファー

ELISA実験には、溶解、コーティング、ブロッキング、洗浄、希釈、検出などに用いる様々なバッファーが必要になります。これらバッファーの基本的なレシピはありますが、大半が市販されており、各種ELISA実験の効率化、迅速化、簡素化、標準化に役立っています。これらのバッファーは、コストを最小限に抑えつつ、特異性、再現性、感度を増加させるように開発されてきました。

CSTは、可能な限り高品質の製品とサポートをご提供するため、一連のELISA製品を自社で開発、製造しています。これらを厳密に検証し、研究者の皆様にご提供しています。CSTのバッファーは、他のELISAキット構成品、またはCSTのELISA抗体ペアとの使用に最適化されており、個々で、またはキットの一部として販売されています。

コーティングバッファー

コーティングバッファーは、抗原や抗体を安定化し、エピトープを変化させずにマイクロプレート表面に受動的に吸着させるために用います。

アミノ酸とマイクロプレートウェルの疎水性相互作用によって、抗原や抗体が吸着し固相化されます。これには温度、pH、濃度、時間などの要因の影響します。

ブロッキングバッファー

ブロッキングバッファーは、検出抗体がマイクロプレートの表面に非特異的に結合するのを防ぐため、コーティングバッファーの後に添加します。このバッファーには、最適な濃度の非イオン性界面活性剤や非特異的なタンパク質が含まれます。抗体の非特異吸着を抑制しつつ、特異的な抗原-抗体反応を阻害しないようにデザインされています。

洗浄バッファー

洗浄バッファーは、各行程で結合しなかった分子を洗浄・除去するために用い、使用後はこのバッファーも除去します。このバッファーには、バックグラウンドノイズを低減させつつ、抗体-抗原複合体を安定に保持するため、適切な濃度の塩類、界面活性剤が含まれ、適切なpHに調整されます。洗浄の回数、洗浄時間、界面活性剤濃度等を最適化する必要があります。

検出バッファー

検出バッファーは、抗体にラベルした酵素の基質を含んでいます。多くの場合、基質はバッファーの条件の影響を受けます。したがって、検出分子の非特異的な分解を低減するため、他のバッファーの組成を十分に考慮する必要があります。

ELISAプレート

ELISAのマイクロプレートには、solid型マルチウェルプレートや、分離が可能なstrip型マルチウェルプレートなどがあります。平底の96ウェルまたは384ウェルのマルチウェルプレートがよく利用されています。ELISA実験における反応条件の最適化、ウェル間、実験間の再現性を考慮して設計されたプレートを使用することが重要です。

また、ELISAの検出方法によってプレートを選択する必要があります ( 比色、蛍光、化学発光)。比色アッセイには、透明のプレート、化学発光の検出には不透明な白色のプレートを使用します。蛍光を検出する場合はバックグラウンドを最小限に抑えるために黒色のプレートを使用します。

ELISAプレートリーダー

ELISAに使用する検出方法によって、測定に用いるマイクロプレートリーダーの種類を決定します。ELISAの検出方法は、定量性のあるダイナミックレンジと、検出感度を考慮して、比色定量、化学発光、蛍光から選択します。