重要：製品がフローサイトメトリー (F) を使用して検証され、使用可能であるかどうかについては、データシートまたは製品ウェブページの最初のページにあるApplicationsセクションをご参照ください。適切な固定、透過化条件、および推奨される抗体の希釈率は、製品ウェブページの製品特有のFlowプロトコールをご参照ください。
A. 溶液および試薬
注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。
- 20X Phospate Buffered Saline (PBS)： (#9808)：1X PBS 1 Lを調製する場合、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
- 16%ホルムアルデヒド (メタノール不含)
- 100%メタノール (必要に応じて)
- インキュベーションバッファー：Bovine Serum Albumin (BSA) (#9998) 0.5 gを1X PBS 100 mLに溶解してください。4℃で保存してください。
- 二次抗体：Anti-mouse (#4408、#8890、#4410、#8887)、Anti-rabbit (#4412、#8889、#4414、#8885)、Anti-rat (#4416、#4418)
B. 固定
注意：生細胞の染色が必要な場合は、免疫染色 (セクションD) に進んでください。抗体が生細胞染色へ使用できるかについては、製品ウェブページや製品ごとのプロトコールをご参照ください。
- 遠心分離で細胞を集め、上清を吸引してください。
- 細胞を1X PBS 0.5-1 mLで再懸濁してください。最終的な濃度が4%になるようにホルムアルデヒドを加えてください。
- 室温で15分間固定してください。
- 1X PBSをさらに加えて遠心分離し、細胞を洗ってください。上清は適切な廃棄容器に捨ててください。細胞を1X PBS 0.5-1 mLで再懸濁してください。
C. 透過化処理
注意：適切な透過化条件は、製品ウェブページ上の製品ごとのプロトコールをご参照ください。すべての製品がメタノールを用いた透過化を使用できるわけではありません。
- 予め冷やした細胞へ、穏やかにボルテックスしながら終濃度が90%になるように氷冷した100%メタノールをゆっくりと加えてください。
- 氷上で30分間インキュベートしてください。
- 免疫染色 (セクションD) を進めるか、細胞を90%メタノール中で-20°Cで保存してください。
D. 免疫染色
注意：細胞数を血球計算盤かその他の方法で計測してください。
- 必要な細胞数をチューブかウェルに分注してください。
- 必要に応じて、1X PBSをさらに加えて遠心分離することで細胞を洗い、メタノールを除去してください。上清は適切な廃棄容器に捨ててください。必要に応じて洗浄を繰り返してください。
- 細胞を一次抗体希釈液 (インキュベーションバッファーで推奨希釈率に調製済み) 100 µL中で再懸濁してください。
- 室温で1時間 (固定細胞) または氷上で15-30分間 (生細胞) インキュベートしてください。
- インキュベーションバッファーを加えて遠心分離し、細胞を洗ってください。上清を捨ててください。繰り返す。直接標識抗体を使用している場合は、ステップ9へ進んでください。
- 細胞を蛍光標識二次抗体 (インキュベーションバッファーで推奨希釈率に調製済み) 100 µL中で再懸濁してください。
- 室温 (固定細胞) または氷上 (生細胞) で30分間インキュベートしてください。
- インキュベーションバッファーを加えて遠心分離し、細胞を洗ってください。上清を捨ててください。繰り返す。
- 1X PBS中で細胞を再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。DNA染色または生死判定のために、オプションでDNA染色 (セクションE) へ進んでください。
E. DNA染色 (固定細胞) と生死判定 (生細胞)
- 細胞をDNA色素 0.5 mLまたは生死判定色素 (e.g. Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087) で再懸濁してください。
- 室温 (固定細胞) または氷上 (生細胞) で5分間インキュベートしてください。
- 必要に応じて、PBSを加えて遠心分離することで洗ってください。細胞をフローサイトメーターで解析してください。
