フローサイトメトリー (生細胞染色プロトコール)

重要：製品ウェブページの製品別のフローサイトメトリープロトコールから、生細胞の染色に使用できるかどうか、また抗体の推奨希釈率をご確認ください。

A. 溶液および試薬

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

1. 1X Phospate Buffered Saline (PBS)：1X PBS 1 Lを用意する場合：100 mLの10X PBS (#12528) を精製水900 mLに加え、混合してください。
2. 抗体希釈バッファー：Flow Cytometry Antibody Dilution Buffer (#13616) をそのまま使用するか、0.5 gのウシ血清アルブミン (BSA) (#9998) を100 mLの1X PBSに溶解して0.5% BSA PBSバッファーを調製してください。4℃で保存してください。
3. 推奨二次抗体​：未標識抗体の検出には、使用する一次抗体の宿主生物種 (例：ラビット) に対応した二次抗体を選択してください。フローサイトメトリー検証済み二次抗体の最新リストは、こちらからご覧いただけます。

注意：実験に蛍光細胞染色色素 (生死判定色素、DNA色素など) を使用する場合は、色素の製品ページの推奨プロトコールを参照してください。フローサイトメトリーでの使用が検証済みの、細胞染色色素の一覧をご覧ください。

B. 免疫染色

注意：細胞数を血球計算盤かその他の方法で計測してください。

注意：全血を用いる場合は、免疫染色の前に赤血球を溶解し、遠心分離して洗浄してください。

注意：免疫染色の前に生細胞をFc Blockでプレインキュベーションすることで、ヒトFc受容体とラビットIgG、マウスFc受容体とラビットIgGまたはマウスのIgGの結合を防ぐことができます。

注意：遠心分離の最適条件は、細胞のタイプと試薬の容量によって異なります。一般的には、150-300 gで1-5分間で細胞を十分にペレット化することができます。

1. 必要な細胞数をチューブかウェルに分注してください。(通常、アッセイごとに5x10⁵-1x10⁶細胞です。)
2. 遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去してください。
3. 細胞を一次抗体反応液100 µLに再懸濁してください。(一次抗体反応液は抗体原液を抗体希釈バッファーで希釈して調製してください。希釈率は製品データシートの推奨希釈率に従うか、タイトレーションを行って決定してください。)
4. 氷上で30分間 - 1時間インキュベートしてください。遮光してください。
5. 抗体希釈バッファーまたは1X PBS中で遠心分離して洗浄してください。上清を捨ててください。繰り返す。直接標識抗体を使用した場合は、ステップ9​へ進んでください。
6. 細胞を二次抗体反応液100 µLに再懸濁してください。(二次抗体反応液は、適切な蛍光色素で標識した二次抗体原液を抗体希釈バッファーで希釈して調製してください。希釈率は製品データシートの推奨希釈率に従ってください。)
7. 氷上で30分間インキュベートしてください。遮光してください。
8. 抗体希釈バッファー内で遠心分離して洗浄してください。上清を捨ててください。繰り返す。
9. 細胞を抗体希釈バッファー200 - 500 μLに再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。