In-Cell Westernプロトコール

A. 溶液および試薬

注意：Milli-Qまたは同等の精製水で溶液を調製してください。

1. 10X Phosphate Buffered Saline (PBS)： 1 Lを準備する場合は、塩化ナトリウム (NaCl) 80 g、塩化カリウム (KCl) 2 g、リン酸水素ナトリウム (Na₂HPO₄) 14.4 g、リン酸カリウム (KH₂PO₄) 2.4 gを精製水 (dH₂O) 1 Lに溶解してください。pHを7.4に調整してください。
2. 16%​ホルムアルデヒド (メタノール不含、Polysciences社製、cat#18814)。新しいものを使用してください。開封後は、暗所に4℃で保存し、使用時にPBSで希釈してください。
3. ブロッキングバッファー：25 mLを調製する場合は、10X PBS 2.5 mL、二次抗体と同じ種の正常血清 (例えば、正常ヤギ血清 (#5425)、正常ロバ血清) 1.25 mL、および精製水 (dH₂O) 21.25 mLを加え、よく混ぜ合わせてください。スターラーで撹拌しながら、Triton X-100 (100%) 75 μLを加えてください。
4. 抗体希釈バッファー： 40 mLを調製する場合は、10X PBS 4 mLを精製水 (dH₂O) 36 mLに加えて混ぜ合わせてください。0.4 gのBSAを加えてよく混ぜ合わせてください。スターラーで撹拌しながら、Triton X-100 (100%) 120 μLを加えてください。
5. 蛍光標識二次抗体

注意：初めて一次抗体あるいは蛍光標識二次抗体をご使用になる際は、至適希釈率を決めるために抗体のタイトレーションを行ってください。

B. 固定と抗体反応

注意：使用する抗体で推奨される固定および透過化条件を調べるため、各抗体特異的な免疫蛍光染色プロトコールを参照してください。

注意：マルチウェルプレート中で直接細胞を培養、薬剤処理、固定および染色してください。

注意：各ウェル内の細胞の偏在によるedge effectを防ぐために、新たに細胞を播いたプレートを37°Cのインキュベーターに入れる前に、室温に1時間置いてください (詳細については、Lundholt BK, Scudder KM, Pagliaro L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J.Biomol. Screen.2003 8, 566–70​​を参照してください)。

注意：散乱光とバックグラウンド蛍光からの擬似シグナルを最小にするために、黒色壁のマルチウェルプレート (例：BD Falcon社製、cat# 353948) を使用してください。

注意：定量に影響を及ぼす恐れがあるので、ピペットやアスピレーターでウェルの内部に触れないでください。ウェルから液を除去する際には、廃液容器上でプレートを逆さにし、すばやく振って、清潔なペーパータオルで拭いてください。

注意：下記には標準的な96ウェルプレート用の容量を記載しています。サイズの異なるプレートをご使用の際は、適宜容量を調整してください。

1. マルチウェルプレートに細胞を培養、処理してください。
2. 各抗体特異的な免疫蛍光染色プロトコールを参照して、例えば4%ホルムアルデヒドまたは100%メタノール50 μLで細胞を固定してください。
3. 細胞を室温で15分間固定してください。
4. アルデヒド廃液容器上でプレートを逆さにして振り、清潔なペーパータオルで拭いてください。
5. プレートを各5分間、室温のPBS (100 μL/ウェル) で3回すすいでください。
6. ブロッキングバッファー (50 μL/ウェル) を加え、1時間室温で細胞をブロッキングしてください。
7. ブロッキングの間に、一次抗体を蛍光免疫染色用の推奨希釈率 (データシートに記載) に抗体希釈バッファーで希釈してください。
8. ブロッキング液を除去し、希釈した一次抗体を添加してください (総容量50 µL/ウェル)。

注意：二重染色の場合は、抗体希釈バッファーで推奨希釈率で希釈したマウスおよびウサギ一次抗体のカクテルを調製してください。

9. プレートを密封し、一晩4°Cでインキュベートしてください。
10. 1X PBSで各5分間、3回すすいでください。
11. 抗体希釈バッファーで希釈した蛍光標識二次抗体を加え (総容量50 µL/ウェル)、室温、暗所で1時間インキュベートしてください。

注意：二重染色の場合は、抗体希釈バッファーで蛍光標識された抗マウスおよび抗ウサギ一次抗体のカクテルを調製してください。

12. 1X PBSで各5分間、3回すすいでください。
13. 抗体ベースの検出系に依存せずに細胞数を標準化するために、PBSで1:​1000に希釈したDRAQ5で細胞核を標識してください (総容量50 µL/ウェル)。スキャンニングの前に、室温、暗所で少なくとも30分間インキュベートしてください。

注意：DRAQ5はDyLight 680標識二次抗体と併用できません。DRAQ5とDyLight 680は発光スペクトルが重複し、各色素のシグナルを区別することができません。

注意：光学的解像度を上げるために、ウェルからDRAQ5を取り除き、少なくとも1回PBSですすいでください。

14. メーカーの指示に従いプレートを読み込んでください。(読み込みの前にプレートの底部が綺麗に拭いてあることを確認してください)。

*推奨二次抗体:

抗ウサギ

• Anti-Rabbit IgG (H+L) (DyLight 680 Conjugate) #5366
• Anti-Rabbit IgG (H+L) (DyLight 800 Conjugate) #5151

抗マウス

• Anti-Mouse IgG (H+L) (DyLight 680 Conjugate) #5470
• Anti-Mouse IgG (H+L) (DyLight 800 Conjugate) #5257