XP^®モノクローナル抗体の優れた特異性

• ウェスタンブロット (図1) では、#4370が最も特異性が高く、バックグラウンドの低い結果が得られました。特記すべきは、#4370を他社抗体に比べて低濃度 (高希釈率) で使用しても、高感度な検出が可能であることです。XP^®モノクローナル抗体は高倍率の希釈で使用が可能なため、貴重な試薬を節約し、アッセイ単価を下げることができます。
• #4370、他社製品1、2を用いた細胞ベースの免疫蛍光染色 (図2) および免疫組織化学染色 (図3) の結果を並べて示しました。この結果からも、#4370が優れた特異性と感度をもつことが分かります。
• ウェスタンブロットで、チロシンがリン酸化された一群のリコンビナントタンパク質を検出する実験 (図4) からも、#4370​は他社製品に比べ、優れた特異性をもつことが示されました。
• #4370は適用可能なアプリケーションが最も多く、また交差する生物種も最多となっています。つまり、本製品一つでp44/42 MAPKのリン酸化を検出する多くのアプリケーションに対応できます。

図 1 血清飢餓処理を一晩行ったJurkat細胞を、そのまま、もしくは既知のp44/42 MAPKアクチベーターであるホルボールエステルで処理し (200 nM TPA #4174、10分間)、ウェスタンブロットで解析しました。#4370はCST推奨希釈率で、他社抗体はいずれもメーカー推奨濃度範囲の最も高い濃度で使用しました。いずれの抗体でもTPA処理で期待通りのシグナルの誘導がみられましたが、他社製品では同時に強いバックグラウンドもみられました。特に他社製品1は多くの交差反応バンドがみられ、一方、他社製品2では全体的に弱いシグナルがみられました。

図 2 血清飢餓処理したHeLa細胞を、MEK 1/2阻害剤であるU0126 #9903 (10 µM、2時間)、またはTPA #4174 (200 nM、30分間) で処理しました。#4370はCSTが推奨する200倍希釈で使用し、他社製品1は、メーカー推奨に従い、希釈率範囲50-500倍希釈の間で最適条件を検討しました。他社製品では最適条件においてもU0126処理した細胞で核および細胞質にバックグラウンドがみられ、TPA刺激した細胞でも弱い拡散した細胞質シグナルがみられたのみでした。#4370による染色ではTPA処理後に期待通りのシグナルの増強がみられましたが、他社製品による染色ではほとんどみられませんでした。これらのことからCST製品でよりクリアな結果が得られることが分かります。

図 3 #4370によるIHC染色を、他社のIHC推奨製品 (2種の濃度) と比較しました。TPA #4174 (上) またはU0126 #9903 (中) で処理したパラフィン包埋NIH/3T3細胞ペレット#8103、およびパラフィン包埋ヒト卵巣がん組織 (下) を、上記抗体でIHC染色しました。細胞ペレットシステムにおいて、#4370ではCSTの推奨する400倍希釈で良好な染色像が得られました。他社製品2では、U0126処理した細胞 (ネガティブコントロール) でみられるバックラウンドを抑えるために400​倍の希釈が必要ですが、この希釈倍率ではTPA処理した細胞 (ポジティブコントロール) でみられるシグナルも大きく減少しました。ヒト卵巣がん組織の染色において、他社製品2では100倍希釈 (推奨範囲内での最低倍率) で用いた場合でもシグナルが弱く、U0126処理した細胞ペレットでみられたようなバックグラウンドとの判別が困難でした。また、他社製品2を400倍希釈で用いた場合では染色がほとんどみられませんでした。一方、ヒト卵巣がんで、#4370で強く特異的な染色像が得られました。

図 4 チロシンがリン酸化された一群のリコンビナントタンパク質をウェスタンブロットで解析した場合、他社製品1、2ではともにチロシンがリン酸化されたタンパク質への交差反応がみられましたが、#4370では交差反応が検出されませんでした。タンパク質のローディングと、タグの付いたリコンビナントタンパク質の分子量を確認するため、Phospho-Tyrosine Mouse mAb (P-Tyr-100) #9411​によるウェスタンブロットの結果も示しました。これらの結果から、#4370が非常に優れた特異性をもつことが分かります。

• ウェスタンブロット (図5) では、#3077によって適切な分子量の特異的なシングルバンドがみられましたが、他社製品ではみられませんでした。
• 様々なRTK阻害剤/活性化因子で処理したパラフィン包埋細胞ペレットのIHC (図6) では、#3077によって特異な染色が確認できましたが、他社製品では確認できませんでした。
• HCC827異種移植片のIHC (図7) では、#3077、他社製品ともに、特異的な染色がみられました。
• さらに、パラフィン包埋ヒト肺がん検体をホスファターゼ処理し、IHC染色像をホスファターゼ未処理のものと比較することで (図8)、#3077の特異性が確認できました。

図 5 #3077を用いたウェスタンブロットで、HGF刺激したA431細胞では145 kDaのシングルバンドがみられましたが、無刺激のA431細胞ではみられませんでした (上)。また、増殖因子処理によるその他のRTKの活性化や、その他のRTK・細胞質のチロシンキナーゼの過剰発現を行った場合でも、非特異なバンドはみられませんでした。これに対して、他社のリン酸化Met抗体を用いた場合では、いくつかの非特異的なバンドがみられました (下)。図中のイメージは、2つのメンブレンを同じフィルム上で同じ時間 (10秒) の露光を行ったものです。

図 6 Met阻害剤SU11274で処理したパラフィン包埋MKN45細胞の免疫組織化学染色では、#3077、他社製品ともに、コントロールでみられた染色がみられなくなりました。EGF処理したMDA-MB-468細胞、HRG処理したT47D細胞 (ともに乳がん細胞株) を、#3077で染色した場合は、コントロールに比べて染色の増強はみられませんでした。一方、これらを他社製品で染色した場合は、非特異的な染色の増強がみられ、その他のRTKと交差反応することが示唆されました。

図 7 パラフィン包埋HCC827異種移植片を、それぞれ#3077 (左)、他社製品 (右) で免疫組織化学染色した場合、どちらの場合でも特異的な染色像が得られました。

図 8 ホスファターゼ処理したパラフィン包埋ヒト肺がん検体を用いて、#3077のリン酸化への特異性を確認しました。