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免疫蛍光染色用抗体の検証

免疫蛍光染色 (IF) には、特異的な一次抗体と蛍光標識二次抗体を用いて細胞タンパク質をラベルする方法 (間接法) と、直接標識された一次抗体でラベルする方法 (直接法) があります。ほとんどの蛍光顕微鏡で、1つのサンプルで2、3種類の蛍光ラベルしたタンパク質の細胞内局在、相対的な発現レベルと活性化状態 (例:リン酸化状態) を観察することが可能です。多重解析を用いることで、組織中に存在する、複数のマーカー解析が必要な細胞集団の解析で、連続切片を用意する必要が無くなり、時間と試薬を節約できます。Cell Signaling Technology (CST) の科学者は、手動方式の蛍光顕微鏡、自動化イメージング、レーザースキャニングハイコンテントプラットフォームなどのIFアプリケーション​で、800もの活性化状態特異的 (例:リン酸化特異的など) 抗体とTotal抗体を検証しています。 免疫蛍光染色アッセイでの使用が推奨されたすべてのCST™抗体は、厳格な検証プロセスに基づいて試験されています。

検証手順は以下の通りです

  • 標的の発現レベルが既知の細胞株または組織を用いて、特異性を検証します。
  • 適切な細胞株と組織を用いて、細胞内局在を検証します。
  • 適切な組織を用いて、抗体のパフォーマンスを評価します。
  • ホスファターゼ処理した細胞を用いて、リン酸化特異性を検証します。標的特異性も、既知のノックアウト細胞株または、null細胞株を用いて検証します。
  • siRNA処理、もしくは標的タンパク質を過剰発現させた細胞を用いて、標的特異性を検証します。
  • シグナル経路の活性を調節するリガンドまたは阻害剤を用いて、活性化状態の特異性、標的の発現および局在変化を調べます。
  • 抗体とアイソタイプの比較でS/N比が閾値になる所要量と、リン酸化特異的抗体の最小のfold-inductionになる所要量により、可能な限りの最大感度が保証されます。
  • 固定条件と浸透化条件は最適化されています。必要に応じて代替プロトコールが推奨されます。
  • 厳格な試験により、ロット間の一貫性を確保します。
ポジティブ/ネガティブ細胞株

MCF7細胞 (AGR2陽性細胞、左) とIGROV-1細胞 (AGR2陰性、右) を用いた共焦点IF解析。細胞をAGR2 (D9V2F) XP® Rabbit mAb #13062 (緑) と β-Actin (8H10D10) Mouse mAb #3700 (赤) で染色し、抗体の特異性を検証しました。青=DRAQ5® #4084 (DNAを染色する蛍光色素)。

活性化剤/阻害剤による処理

Mouse Tumor Necrosis Factor-α (mTNF-α) #5178で処理 (20 ng/mL、30分間) したC2C12細胞 (右) と、未処理コントロール細胞 (左) の、共焦点免疫蛍光解析。細胞をNF-κB1 p105/p50 (D4P4D) Rabbit mAb #13586 (緑) で染色しました。アクチンフィラメントをDyLight™ 554 Phalloidin #13054 (赤) で染色しました。青=DRAQ5® #4084 (DNAを染色する蛍光色素)。

Pdx1 Antibody #2437 performance is assessed on appropriate tissues.

Pdx1 Antibody #2437: 正常ラット膵臓組織の共焦点免疫蛍光解析。組織をPdx1 Antibody #2437 (緑、上) もしくは Insulin (C27C9) Rabbit mAb #3014 (緑、下) で染色しました。また、ケラチン繊維をPan-Keratin (C11) Mouse mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4528 (青) で可視化しました。赤=Propidium Iodide/RNase #4087 (DNAを染色する蛍光色素)。

PDI #2446 and β-Actin #3700 performance is assessed on appropriate tissues.

PDI Antibody #2446 and β-Actin (8H10D10) Mouse mAb #3700: NIH/3T3細胞の共焦点IF解析。メタノール (上) もしくは0.3% Triton X-100 (下) で透過化処理した細胞を、#2446 (緑)、 #3700 (赤) で染色しました。また、DNAをDRAQ5® #​4084で染色して青の疑似カラーで示しました。

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