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ウェスタンブロッティング用抗体の検証

ウェスタンブロッティングは、細胞または組織におけるタンパク質発現を検査、測定するための、最も一般的な科学的方法の1つです。ウェスタンブロットの結果の精度は、用いる一次抗体の品質に大きく依存します。Cell Signaling Technology (CST) は、ウェスタンブロッティングで使用できる高品質な一次抗体と二次抗体を提供しています。CST™抗体は社内で製造され、厳格なプロトコールに従って検証されています。

検証手順は以下の通りです

  • 発現レベルが分かっている細胞株や組織を用いることで、生物種間の交差性および抗原に対する特異性を綿密に検証します。
  • 標的の発現を誘導もしくは阻害する、増殖因子や活性化剤・阻害剤を処理した細胞株を用いて、特異性を検証します。また、リン酸化抗原特異的な抗体については、ホスファターゼ処理によるリン酸化特異性の確認を行います。
  • siRNAトランスフェクション、あるいはノックアウト細胞株を用いたて標的特異性を検証します。
  • 各ロットの製品を並べて比較し、ロットごとの一貫性を確認します。
  • 適切なポジティブ、ネガティブコントロールを選定し、至適の希釈率やバッファー条件が決定されています。至適化された詳細なプロトコールが作成されているため、貴重な時間と試薬を節約することができます。
Bcl-xL #6362​および#6363​を用いたsiRNAトランスフェクションまたはノックアウト実験

HeLa細胞に、コントロールもしくはBcL-xLを標的とするsiRNA (SignalSilence® Control siRNA (Unconjugated) #6568 (-)、SignalSilence® BcL-xL siRNA I #6362 (+)、SignalSilence® Bcl-xL siRNA II #6363 (+)、それぞれ100 nM) をトランスフェクションしました。細胞抽出物を、Bcl-xL (54H6) Rabbit mAb #2764 (上)、 α-Tubulin (11H10) Rabbit mAb #2125 (下) を用いたウェスタンブロッティングで解析し、抗体の特異性を検証しました。この結果、Bcl-xL (54H6) Rabbit mAbにより、Bcl-xL発現のサイレンシングが確認されました。α-Tubulin (11H10) Rabbit mAbはローディングコントロールとして用いました。

293、NIH/3T3、C6細胞ライセートのウェスタンブロット解析。

293細胞、NIH/3T3細胞、C6細胞を、図中に示したように、λホスファターゼもしくはTPA #4174で処理しました。細胞抽出物を、Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP® Rabbit mAb #4370 (上)、p44/42 MAPK (Erk1/2) (137F5) Rabbit mAb #4695 (下) を用いたウェスタンブロッティングで解析しました。

JIP4/SPAG9 (D72F4) XP Rabbit mAb #5519​を用いた複数の細胞株の解析。

様々な組織や細胞株の抽出物を、JIP4/SPAG9 (D72F4) XP® Rabbit mAb #5519を用いたウェスタンブロッティングで解析しました。

ウェスタンブロット解析に最適な希釈率とバッファーがあらかじめ設定されています。

EGF Receptor Control Cell Extracts #5634を用いて検証し、Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (D7A5) XP® Rabbit mAb #3777 (上) および、EGF Receptor (D38B1) XP® Rabbit mAb #4267の、ウェスタンブロッティングにおける条件の至適化を行いました。

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