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PTMScan® Discoveryプロテオミクスサービス

PTMScan Discoveryプロテオミクスサービスワークフロー

PTMScan® Discoveryにより、1回のLC-MS/MSで、数百から数千の新規の翻訳後修飾 (PTM) 部位を同定することができます。

PTMScan Discoveryの特徴

  • CSTが開発したPTM抗体およびモチーフ抗体を用いた、PTM含有ペプチドの濃縮
  • 濃縮されたペプチドの定量解析のためのLC-MS/MS
  • ヒト、マウス、ラット、ショウジョウバエ、シロイヌナズナなど、多くの生物種由来のサンプルで使用可能

お客様ご自身のペプチド濃縮やLC-MS/MSをご希望される場合は、弊社のPTMScanキット一覧をご覧ください。

PTMScan Discoveryで同定された解析候補タンパク質の多くは、CSTの​PTM特異的抗体およびトータル抗体を用いて追加検証できます。これらの抗体は社内で製造し、複数のアプリケーションについて検証されています。

タンパク質のユビキチン化は、プロテアソームによるタンパク質分解、エンドサイトーシス、DNA修復、細胞周期の制御、遺伝子発現など、多くの細胞プロセスに関与しています。ユビキチン化の異常は、がんや神経変性疾患、メタボリックシンドロームなど様々な疾病に関与しています。

UbiScan®技術では、ユビキチン化タンパク質がトリプシン消化された際に、リジン残基上に生じるジグリシンレムナント (K-ε-GG) に対するCST独自の抗体を使用します。このユビキチンレムナントモチーフ抗体を用いて、トリプシン消化サンプルからユビキチン化ペプチドを濃縮し、LC-MS/MS解析により数千種類のユビキチン化ペプチドを定量的にプロファイリングします。(NEDD8やISG15など、その他のユビキチン様修飾因子もK-ε-GGレムナントを残します。)

UbiScanのプロセス

ユビキチロームの大規模な定量解析、K-ε-GGレムナントモチーフ抗体を用いたPTMScan技術の応用例にご興味をお持ちの方は、ウェビナーをご覧ください

UbiScanプロテオミクスサービス

ターゲット モチーフ 参考データ
ターゲット モチーフ 参考データ
Ubiquitin Remnant K-ε-GG マウス肝臓 | XLS | RAW

Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) タンパク質は、タンパク質を可逆的に修飾する低分子タンパク質で、標的タンパク質のリジン残基に共有結合を形成して結合します。タンパク質のSUMO化は、以下のような多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を担っています。

  • 核輸送
  • DNA複製と修復
  • 有糸分裂
  • シグナル伝達

PTMScan® Sumoylation Remnant Motif技術では、WaLPで消化したサンプルからCST独自の抗体でSUMO化ペプチドを濃縮します。スレオニン、バリン、アラニン、セリンに対して特異的でユニークなプロテアーゼであるWaLPは、SUMOのC末端のジグリシン (GG) を基質側に残して切断し、SUMO化基質のリジン残基に「タグ」のようにジグリシンレムナント (K-ε-GG) を生成します。その後、得られたK-ε-GG含有ペプチドは、ユビキチンプロファイリングと同様の方法で同定することができます (UbiScan®技術) (図1)。それ故、同じサンプルをWaLP消化するかトリプシン消化するかの違いで、SUMOとユビキチンの両方のプロファイリングに用いることができます。

PTMScan® Sumoylation Remnant Motif技術により同定されたK-ε-GG部位が、ユビキチン化タンパク質由来ではなくSUMO化タンパク質由来であることを確認するため、特異的な脱SUMO化酵素 (SENP 1およびSENP 2) を用いて特異性を検証しました (図2)。この結果から、ユビキチン化ペプチドが、SUMO化サンプルに混入していないことが確認できました。

PTMScan® Sumoylation Remnant Motif 概略図

K-ε-GGレムナントモチーフ抗体を使用した、SUMO化ペプチドの濃縮 (左) と、ユビキチン化ペプチドの濃縮 (右) 手法の図解。

PTMScan® Sumoylation Remnant Motif K-ε-GGペプチド

SENP1および2で処理したSUMO化タンパク質由来 (A) とユビキチン化タンパク質由来 (B) のK-ε-GGペプチドの定量結果。SUMO化ペプチドはSENP処理によって減少しましたが、一方でユビキチン化ペプチドでは変化しませんでした。また、この結果はウェスタンブロッティングのデータと一致していました。

MethylScanプロセス

様々なメチル化抗体とそれらが認識する修飾

タンパク質のメチル化は一般的な翻訳後修飾 (PTM) であり、その多くはアルギニン残基とリジン残基で起こります。アルギニンのメチル化は、RNAプロセシング、遺伝子転写、DNA損傷の修復、タンパク質の移行およびシグナル伝達などのプロセスを制御しています。リジンのメチル化は、ヒストン機能を制御することで最もよく知られており、遺伝子転写のエピジェネティックな制御に関与しています。

MethylScan®技術では、CST独自のメチル化アルギニン (Me-R) またはメチル化リジン (Me-K) 抗体を用い、プロテアーゼ消化したサンプルからメチル化修飾を含むペプチドを濃縮します。CSTのメチル化抗体は、ペプチド阻害実験やペプチドアレイなどで、綿密な試験を行い、特異性や感度を厳密に確認しています。これらの抗体は、メチル化修飾の様式 (モノメチル化、ジメチル化など) や、修飾されたアミノ酸残基 (アルギニン残基、リジン残基) をそれぞれ区別して認識するよう、設計・構築されています。

MethylScan®メチル化プロテオミクスを実施している文献をご覧ください

MethylScan Dot Matrix

マウスの脳および胚におけるアルギニンメチル化の定量解析​:散布図の各プロットは、PTMScan® Mono-Methyl Arginine Motif [mme-RG] Kit #12235で同定した個々のアルギニンモノメチル化ペプチドを表しています。X軸はマウスの脳および胚のモノメチル化部位のペプチドの総強度をlog10の値で表し、Y軸はマウスの脳と胚のペプチドのlog2強度比を表しています。カットオフ値を5倍に設定し、脳、胚で増加がみられるアルギニンモノメチル化ペプチドをそれぞれ緑点、赤点で示しました。脳または胚の一方のみで検出され、比の算出ができないメチル化ペプチドのlog2比については、脳特異的なものを15、胚特異的なものを-15としてプロットしました。脳や胚で濃縮された代表的なメチル化ペプチドをいくつか、グラフ上でハイライトして示しました。

PTMScan®プロテオミクスサービス

ターゲット モチーフ 参考データ
ターゲット モチーフ 参考データ
Mono-Methyl Arginine R-Me マウス胚 | XLS | RAW
Asymmetric Di-Methyl Arginine R-2Me(a)  
Symmetric Di-Methyl Arginine R-2Me(a)  
Pan-Methyl Lysine K-Me, K-2Me, K-3Me  
Acylscanワークフロー

マウス (野生型、SirT5ノックアウト型) の肝臓ペプチドにおけるリジンのアシル化プロファイリング:ベン図はここに示した4種類のアシル化特異的抗体を用いて同定された修飾部位の重複度を示しています。下表の「参考データ」より、完全なデータセットをご覧いただけます。

リジン残基は、側鎖のε-アミノ基が正電荷を帯びており、ここに様々な翻訳後修飾 (PTM) を受けます。アシル基は、代謝中間体であるアセチルCoA、スクシニルCoA、マロニルCoA、グルタリルCoA、ブチリルCoA、プロピオニルCoA、クロトニルCoAから転移し、正電荷を帯びたリジンを中和して構造を変化させ、基質タンパク質の機能に影響を及ぼします。アシル化により制御される細胞機能には、細胞周期の制御、ミトコンドリア代謝、細胞骨格の制御、タンパク質間相互作用などがあります。

Acylscanベン図

AcylScan™ 技術によるアシル化プロテオミクスでは、CST独自のアセチルリジン (Ac-K)、グルタリルリジン (Glut-K)、マロニルリジン (Mal-K)、プロピオニルリジン (Prop-K)、スクシニルリジン (Succ-K) 抗体を用い、LC-MS/MS解析の前に、トリプシン消化したサンプルからそれぞれのアシル化修飾を含むペプチドを濃縮します。

AcylScan™サービス

サービス ターゲット モチーフ 参考データ
サービス ターゲット モチーフ 参考データ
AcetylScan® Acetyl-Lysine Ac-K マウス肝臓 | XLS | RAW
GlutarylScan™ Glutaryl-Lysine Glut-K  
MalonylScan™ Malonyl-Lysine Mal-K  
PropionylScan™ Propionyl-Lysine Prop-K  
SuccinylScan™ Succinyl-Lysine Succ-K  

PTMScan Discoveryワークフロー

キナーゼタンパク質による可逆的なリン酸化は、タンパク質の機能を活性化または阻害します。MAPキナーゼシグナル伝達経路に代表される、リン酸化シグナル伝達カスケードは、細胞外から細胞内への情報伝達に重要で、最終的に遺伝子転写の制御を行います。がん、糖尿病、神経変性疾患など多くの疾患でリン酸化の異常が確認されており、タンパク質のリン酸化状態を明らかにすることは、生理的および病理的な細胞プロセスを理解するために極めて重要と言えます。

PhosphoScan®プロテオミクスの応用例

  • シグナル経路のプロファイリング
  • バイオマーカーの探索
  • 創薬ターゲットの選定、ターゲットバリデーション

抗体による濃縮をリン酸化プロテオミクスで行う利点について

  • IMACに比較して抗体ベースの方法は、特定のアミノ酸 (S/T/Y) のリン酸化部位の同定、または特定のアミノ酸モチーフ上のリン酸化の同定に適しています。
  • PTMScan®法とIMACでは、異なるリン酸化ペプチドのプールを濃縮するため、両者は高度に相補的な関係にあります。両方の濃縮を行うことで、データセットはより完全なものに近づくと言えます。データをご覧ください

PTMScan Discovery Dot Matrix

MKN-45細胞におけるチロシンリン酸化のプロファイリング1 μM SU11274、200 nM Staurosporine #9953またはDMSO (コントロール) で2時間処理したMKN-45細胞からペプチドを調整し、PTMScan® Phospho-Tyrosine Rabbit mAb (P-Tyr-1000) Kit #8803を使用して濃縮を行いました (上)。平行して、濃縮操作を行わないサンプルをLC-MS/MSで解析し、総タンパク量のプロファイリングを行いました (下)。SU11274またはStaurosporine処理で、量が減少したペプチドは赤で、増加したペプチドは緑で表示されています。Analytical replicateの%CV値の中央値およびヒストグラムを右に示しました。

PhosphoScanサービス

注意:ご希望のセリン/スレオニンモチーフ抗体の特注ミックスセットを解析サービス用にご用意できます。お問い合わせください

ターゲット モチーフ 参考データ
ターゲット モチーフ 参考データ
14-3-3 Binding Motif (R/K)XX(s/t)XP  
Akt Substrate RXX(s/t) マウス肝臓 | XLS | RAW
Akt Substrate RXRXX(s/t) マウス肝臓 | XLS | RAW
AMPK Substrate LXRXX(s/t) マウス肝臓 | XLS | RAW
ATM/ATR Substrate (s/t)Q マウス肝臓 | XLS | RAW
ATM/ATR Substrate (s/t)QG マウス肝臓 | XLS | RAW
CDK Substrate (K/R)(s/t)PX(K/R)  
CK2 Substrate (s/t)(D/E)X(D/E)  
MAPK/CDK Substrate PX(s/t)P, (s/t)PX(K/R) マウス肝臓 | XLS | RAW
PDK1 Docking Motif (F/K)XX(F/Y)(s/t)F/Y) マウス肝臓 | XLS | RAW
PKA Substrate (K/R)(K/R)X(s/t) マウス肝臓 | XLS | RAW
PKC Substrate (K/R)X(s/t)X(K/R) マウス肝臓 | XLS | RAW
PKD Substrate LXRXX(s/t)  
PLK Binding Motif S(s/t)P マウス肝臓 | XLS | RAW
tP Motif (s/t)P, (s/t)PP  
tPE Motif (s/t)PE マウス肝臓 | XLS | RAW
tXR/tPR Motif (s/t)XR, (S/t)PR マウス肝臓 | XLS | RAW
Phospho-Tyrosine (pY-1000) y マウス脳 | XLS | RAW

アポトーシスの外因性および内因性経路には、カスパーゼカスケードが関与します。ヒトプロテオームには、数千にも及ぶ既知のまたは推定上のカスパーゼ切断部位が含まれています。多くの場合、カスパーゼはアスパラギン酸残基のC末端側を切断し、C末端にアスパラギン酸残基をもつフラグメントが産生されます。いくらか多様性がありますが、一般的にカスパーゼはDEXDモチーフを認識して切断します。

PTMScan®技術によるカスパーゼ切断基質のプロテオミクスでは、DEXDモチーフに対するCST独自の抗体を用いて、トリプシン消化したサンプルからカスパーゼで切断された基質を濃縮し、LC-MS/MSで解析します。

カスパーゼのシーケンシング

カスパーゼ切断基質プロテオミクス: Staurosporine #9953 処理 (1 μM、3時間) でアポトーシスを誘導したHeLa細胞からペプチドサンプルを調製し、PTMScan®LC-MS/MSで解析しました。上記モチーフロゴは、C末端にアスパラギン酸を持つ1044種類の非冗長トリプシン消化ペプチドの解析結果から作成しました。ペプチドの濃縮にはPTMScan® Cleaved Caspase Substrate Motif [DE(T/S/A)D] Kit #12810を使用しました。モチーフロゴは、C末端にアスパラギン酸をペプチドの、アミノ酸の相対的な出現頻度を表しています。

Cleaved Caspase Substrate Motif [DE(T/S/A)D] MultiMab Western Blot

Cleaved Caspase Substrate Motif [DE(T/S/A)D] MultiMab® Rabbit mAb mix #8698: Staurosporine #9953 処理 (1 μM、3時間) したNIH/3T3細胞、HeLa細胞と、未処理細胞の解析。Cleaved Caspase Substrate Motif [DE(T/S/A)D] MultiMab® Rabbit mAb mix (上)と、GAPDH (D16H11) XP® Rabbit mAb #5174 (下、ローディングコントロール) を用いたウェスタンブロット 。

カスパーゼ開裂基質のプロテオミクスサービス

ターゲット モチーフ 参考データ
ターゲット モチーフ 参考データ
Cleaved Caspase Substrate DEXD  

タンパク質N末端のアセチル化は普遍的な翻訳後修飾 (PTM) で、典型的には新たに翻訳されたタンパク質で起こる修飾ですが、タンパク質の新規合成とは無関係に起こる場合もあります。N末端のアセチル化は、バクテリアから高等真核生物まで保存された修飾です。この修飾は、N末端アセチルトランスフェラーゼ (NAT) 酵素群によって触媒されます。一部のNATファミリーメンバーは、新生ポリペプチドのN末端開始メチオニンを修飾しますが、開始メチオニンが切除された後に露出したN末端をアセチル化するものもあります。N末端アセチル化は、タンパク質の局在、タンパク質間相互作用、タンパク質安定性などのプロセスを制御します。また、NATはがんや神経変性疾患、その他ヒトの遺伝性の致死性疾患にも関与しています。

N-AcetylScan®技術によるN末端アセチル化プロテオミクスでは、CST独自のN末端アセチル (N-AC) 抗体を用いて、プロテアーゼ消化サンプルからN末端アセチル化修飾を含むペプチドを濃縮します。CSTのN末端アセチル化抗体は、ELISA、ウェスタンブロット、PTMScan®テストなどで綿密な試験を行い、特異性や感度を厳密に確認しています。この抗体は、N末端アセチル化ペプチドのみを識別するために最適に設計・構築されています。PTMScan® Discoveryモチーフロゴ

このモチーフロゴは、PTMScan® N-Terminal Acetyl Motif Immunoaffinity Beadsを用いて免疫沈降した、マウス肝臓、脳、胚組織由来の839非冗長トリプシンペプチドを使用して、N-Terminal AcetylScan® LC-MS/MS実験によって作成されました。このロゴは、このデータセットから算出した、N末端残基からの各位置のアミノ酸の相対頻度を表しています。

N末端AcetylScan®サービス

ターゲット モチーフ 参考データ
ターゲット モチーフ 参考データ
N末端AcetylScan Acetyl-NH2-X マウス組織 | XLS | RAW

From Bench to Bedside

PTMScan Discoveryワークフロー、ケーススタディ

CSTは、非小細胞肺がん (NSCLC) におけるチロシンキナーゼ活性の大規模解析を行い、新規の疾患誘発因子を特定しました (1)。リン酸化チロシン抗体を用いて、NSCLC細胞株41種およびNSCLC腫瘍150症例からリン酸化ペプチドを濃縮し、LC-MS/MS解析を行いました。その結果、2700種以上のタンパク質上から、4551箇所のリン酸化チロシン残基が同定されました。この解析でトップヒットした上位10に、チロシンキナーゼALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) が含まれていました。

EML4-ALKの融合タンパク質

さらに研究を進め、NSCLC細胞株および腫瘍症例の一部では、ALKのC末端とEML4 (Echinoderm Microtubule-associated protein-like 4) のN末端が融合していることが分かりました。3-7%のNSCLC患者の腫瘍組織でこの融合タンパク質が発現していることが明らかにされ、この融合タンパク質が高い発がん性をもつことが示唆されています (1-4)。EML4-ALK融合タンパク質を発現しているがん細胞は、低分子ALK阻害薬クリゾチニブが奏効するため、2011年にクリゾチニブのALK陽性NSCLCへの適用がFDAに認可されました (2)。

CSTは高い特異性と感度を備えた抗体、ALK (D5F3®) XP®Rabbit mAb #3633を開発しました。この抗体は全長ALKとEML4-ALK融合タンパク質を検出します。このCSTがライセンス化したALK抗体 (クローンD5F3) を用いた、免疫組織化学染色 (IHC) によるコンパニオン診断が、FDAに認可されています (3)。この診断は、医師がNSCLC患者にクリゾチニブの投与を判断する際に役立っています。

ALK発現のIHC解析

ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb #3633を用いた、パラフィン包埋ヒト肺がんのIHC解析。ALKの発現が高い症例 (上) と、低い症例 (下)。

参考文献

  1. Rikova K, Guo A, Zeng Q, Possemato A, Yu J, Haack H, Nardone J, Lee K, Reeves C, Li Y, Hu Y, Tan Z, Stokes M, Sullivan L, Mitchell J, Wetzel R, Macneill J, Ren JM, Yuan J, Bakalarski CE, Villen J, Kornhauser JM, Smith B, Li D, Zhou X, Gygi SP, Gu TL, Polakiewicz RD, Rush J, Comb MJ (2007) Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell 131(6), 1190–203.
  2. FDA approves Xalkori with companion diagnostic for a type of late-stage lung cancer
  3. Ventana receives FDA approval for the first fully automated IHC companion diagnostic to identify lung cancer patients eligible for XALKORI® (crizotinib)
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