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CUT&RUN

Learn about CUT&RUN - a low cell number alternative to ChIP-qPCR and ChIP-seq to analyze protein-DNA interaction in chromatin.

What is CUT&RUN?

クロマチン免疫沈降 (ChIP) やChIP-seqといったタンパク質とDNAの相互作用をマッピングする技術が開発されたことで、エピジェネティクス制御の異常が様々な疾患の原因となることが分かってきました。Cleavage Under Target & Release Using Nuclease (CUT&RUN) is a new technology that can be used for chromatin profiling.

原理

CUT&RUNはin vivo解析技術で、標的に特異的な一次抗体とProtein A-Protein G-Micrococcal Nuclease (pAG-MNase) を用いて特定のタンパク質-DNA複合体を分離します1,2,3。この手法は細胞から目的のDNAをわずか1 - 2日で回収することができ、自動化してスループットと再現性を最大限に高めることもできます4

CUT&RUN概略図

目的のタンパク質とDNAの複合体を得るため、はじめに細胞をコンカナバリンAでコーティングした磁気ビーズに結合させます。これによって細胞の取り扱いを簡便化し、後の洗浄操作での脱落を最小限に抑えます。細胞膜をジギトニンで透過化処理して一次抗体の核への進入を促進し、目的のヒストン、転写因子あるいはコファクターに結合させます。次に、pAG-MNase融合タンパク質のpAGドメインが一次抗体重鎖に結合し、目的のクロマチン領域に酵素を配置します。Ca2+を加えることでpAG-MNaseが活性化され、DNAの消化が起こります。これによって切り出されたクロマチン複合体がゲノムクロマチンから解離して核外に拡散します。こうしてサンプルの上清に拡散したDNAをスピンカラム、あるいはフェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿で回収します。

精製、濃縮されたDNAはqPCRによる同定や定量、あるいはライブラリーを構築して次世代シーケンサー (NGS) による全ゲノム解析に用いることができます。

CUT&RUNの利点

Cell Signaling Technology® (CST) は、ほかの全ゲノムマッピング技術が持つ多くの課題を克服する、CUT&RUNアッセイを提供します。CSTの提供するCUT&RUNアッセイキットには次のような利点があります。

微量サンプルの解析が可能 必要な細胞数はわずか10万です
短時間でデータを取得可能 わずか1-2日で細胞から目的のDNAが得られます
シーケンシングコストの低減 必要な高品質リード数はわずか300-500万です
多様な標的に対応 ヒストンやヒストン修飾、転写因子、コファクターのqPCRデータやシーケンシングデータが得られます
多様な抗体に対応 ラビット抗体およびマウス抗体でご利用いただけます
再現性の高い結果 スパイク・インDNAを利用してサンプル間のシグナルを標準化することができます
「クロスリンクアーティファクト」の回避 未変性のクロマチンを用いたin vivo解析法です

 

微量サンプルの解析が可能

10万の細胞からタンパク質-DNA相互作用の解析が可能なので培養の時間を節約することができ、存在量の少ない細胞からエピジェネティクス情報を得ることもできます。

細胞数を漸減した場合のCUT&RUN結果

CUT&RUN Assay Kit #86652を用いてCUT&RUN行った場合、サンプルのHCT116細胞の数を徐々に減らしても同様の結果が得られました。左パネルにはTri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751を用いた解析の結果、右パネルにはPhospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb #13499を用いた解析の結果を示しました。SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989を用いて濃縮されたDNAをリアルタイムPCRで解析しました。PCRに用いたプライマーセットはそれぞれ、SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516SimpleChIP® Human β-Actin Promoter Primers #13653SimpleChIP® Human β-Actin 3' UTR Primers #13669SimpleChIP® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490です。CUT&RUNで回収されたDNA量をインプットクロマチンに対する相対量 (100,000細胞の総クロマチン量を100%とした相対値) で示しました。それぞれの反応系に加えたスパイク・インDNAでデータを標準化しました。

短時間でデータを取得可能

標的クロマチンの濃縮時間を節約できます。わずか1 - 2日で細胞から目的DNAが得られます。

シーケンシングコストの低減

バックグラウンドが低いので、低深度のシーケンシングでシグナルをゲノムのバックグラウンドノイズと区別することができます。シーケンシングデータを得るのに必要な高品質リードの数はわずか300-500万で、シーケンシングコストが大幅に低減されます。また、バックグラウンドが低いので、シグナルの弱いゲノム特性のプロファイル作成も可能です。

多様な標的に対応

精製、濃縮されたDNAをシーケンシングやqPCRに用いてヒストン修飾や転写因子、コファクターの解析を行うことができます。

ヒストン修飾

ヒストン修飾の解析においてCUT&RUN Assay Kit #86652はChIP-qPCRおよびChIP-seqと同等に機能し、わずか100,000細胞からデータが得られます。

CUT&RUNおよびChIPのH3K4me3 qPCR結果

CUT&RUN Assay Kit #86652またはSimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005を用いてCUT&RUN (左パネル) およびChIPアッセイ (右パネル) を行いました。それぞれTri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751またはRabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362を用いてを用いてHCT116細胞 (CUT&RUNに1x105細胞、ChIPに4x106細胞を用いました) を解析しました。SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989を用いて濃縮されたDNAをリアルタイムPCRで定量しました。PCRに用いたプライマーセットはそれぞれSimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486です。各サンプルで回収されたDNA量をインプットクロマチンの総量 (1に相当) に対する相対量で示しました。

CUT&RUNおよびChIPのH3K4me3シーケンシング結果

CUT&RUN Assay Kit #86652またはSimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005を用いてCUT&RUNおよびChIPアッセイを行いました。それぞれTri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751を用いてHCT 116細胞 (CUT&RUNに1x105細胞、ChIPに4x106細胞を用いました) を解析しました。DNAライブラリーは、SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795を用いて調製しました。12番染色体の広域に渡る濃縮の比較をパネルA、H3K4me3修飾されることが知られるGAPDH遺伝子の濃縮の比較をパネルBに示しました。InputトラックにはCUT&RUNのインプットサンプルから得られたデータを示しました。

転写因子

転写因子のDNA-タンパク質相互作用の解析においてCUT&RUN Assay Kit #86652はChIP-qPCRやChIP-seqと同等に機能し、わずか100,000細胞からデータが得られます。

CUT&RUNおよびChIPのCTCF qPCR結果

CUT&RUN Assay Kit #86652またはSimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005を用いてCUT&RUN (左パネル) およびChIPアッセイ (右パネル) を行いました。それぞれCTCF (D31H2) XP® Rabbit mAb #3418またはRabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362を用いてHCT116細胞 (CUT&RUNに1x105細胞、ChIPに4x106細胞を用いました) を解析しました。SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989を用いて濃縮されたDNAをリアルタイムPCRで定量しました。PCRに用いたプライマーセットはそれぞれヒトc-Mycプロモータープライマー、SimpleChIP® Human H19/Igf2 ICR Primers #5172SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486です。各サンプルで回収されたDNA量をインプットクロマチンの総量 (1に相当) に対する相対量で示しました。

CUT&RUNおよびChIPのCTCFシーケンシング結果

CUT&RUN Assay Kit #86652またはSimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005を用いてCUT&RUNおよびChIPアッセイを行いました。それぞれCTCF (D31H2) XP® Rabbit mAb #3418を用いてHCT116細胞 (CUT&RUNに1x105細胞、ChIPに4x106細胞を用いました) を解析しました。DNAライブラリーは、SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795を用いて調製しました。8番染色体の広域に渡る濃縮の比較をパネルA、CTCFの既知の標的であるMYC遺伝子の濃縮の比較をパネルBに示しました。InputトラックにはCUT&RUNのインプットサンプルから得られたデータを示しました。

コファクター

コファクターのDNA-タンパク質相互作用の解析においてCUT&RUN Assay Kit #86652はChIP-qPCRやChIP-seqと同等に機能し、わずか100,000細胞からでデータが得られます。

CUT&RUNおよびChIPのRpb1 CTD qPCR結果

CUT&RUN Assay Kit #86652またはSimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005を用いてCUT&RUN (左パネル) およびChIPアッセイ (右パネル) を行いました。それぞれRpb1 CTD (4H8) Mouse mAb #2629またはRabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362をを用いHeLa細胞 (CUT&RUNに1x105細胞、ChIPに4x106細胞を用いました) を解析しました。SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989を用いて濃縮されたDNAをリアルタイムPCRで定量しました。PCRに用いたプライマーセットはそれぞれSimpleChIP® Human RPL30 Exon 3 Primers #7014SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516SimpleChIP® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490です。各サンプルで回収されたDNA量をインプットクロマチンの総量 (1に相当) に対する相対量で示しました。

CUT&RUNおよびChIPのRpb1 CTDシーケンシング結果

CUT&RUN Assay Kit #86652を用いてCUT&RUNおよびChIPアッセイを行いました。それぞれRpb1 CTD (4H8) Mouse mAb #2629を用いてHeLa細胞 (CUT&RUNで1x105細胞、ChIPで4x106 細胞を用いました) を解析しました。DNAライブラリーは、SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795を用いて調製しました。12番染色体の広域に渡る濃縮の比較をパネルA、Rpb1の既知の標的であるGAPDH遺伝子の濃縮の比較をパネルBに示しました。InputトラックにはCUT&RUNのインプットサンプルから得られたデータを示しました。

多様な抗体に対応

pAG-MNaseはマウス抗体とラビット抗体の両方に結合するので、非常に多くの抗体をCUT&RUNアッセイに用いることができます。

ラビット抗体

CUT&RUNはラビット抗体と適合性があります

CUT&RUN Assay Kit #86652を用いてHeLa細胞をAcetyl-Histone H3 (Lys27) (D5E4) XP® Rabbit mAb #8173によるCUT&RUNで解析しました。DNAライブラリーは、SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795を用いて調製しました。12番染色体の広域に渡る濃縮の比較をパネルA、H3K27Ac修飾されることが知られるGAPDH遺伝子の濃縮の比較をパネルBに示しました。

マウス抗体

CUT&RUNはマウス抗体と適合性があります

CUT&RUN Assay Kit #86652を用いてHeLa細胞をRpb1 CTD (4H8) Mouse mAb #2629によるCUT&RUNで解析しました。DNAライブラリーは、SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795を用いて調製しました。12番染色体の広域に渡る濃縮の比較をパネルA、Rpb1の既知の標的であるGAPDH遺伝子の濃縮の比較をパネルBに示しました。

高い再現性

異種のスパイク・インDNAを用いてデータを標準化し、実験の再現性を向上させます。既定の実験や異なる実験のサンプル間で標準化を行います。

CUT&RUNアッセイシグナルはスパイクインDNAで正常化することができます

qPCR解析におけるスパイク・インDNAを用いたCUT&RUNシグナルの標準化。CUT&RUN Assay Kit #86652を用いてTri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 (上パネル) またはPhospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb #13499 (下パネル) による異なる数のHCT 116細胞のCUT&RUNアッセイを行いました。SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989を用いて濃縮されたDNAをリアルタイムPCRで解析しました。PCRに用いたプライマーセットはそれぞれ、SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516SimpleChIP® Human β-Actin Promoter Primers #13653SimpleChIP® Human β-Actin 3' UTR Primers #13669SimpleChIP® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490です。CUT&RUNで回収されたDNA量をインプットクロマチンに対する相対量 (100,000細胞の総クロマチン量を100%とした相対値) で示しました。標準化前の濃縮を左パネルに示しました。開始細胞数に比例的にスパイク・インDNAを各反応に加えました。各サンプルのスパイク・インDNAのqPCRシグナルの違いをもとに、CUT&RUNシグナルを100,000細胞のサンプルに標準化しました。標準化した濃縮を右のパネルに示しました。

「クロスリンクアーティファクト」の回避

CUT&RUNは未変性クロマチンを用いて行い、クロスリンクや免疫沈降を必要としないので「クロスリンクアーティファクト」が起こりません。

製品のご提供

CSTはエピジェネティクス解析の初心者から専門家まで、柔軟にご利用いただけるCUT&RUNアッセイ製品をご提供しています。お客様ご自身で別途ご用意いただく必要があるものは、標的タンパク質に対する一次抗体のみです。そのほか全ての必要なバッファーや試薬、詳細なプロトコールはCSTがキットにまとめてご提供します。お客様の必要に応じてpAG-MNase and spike-in DNAのみを別途お求めいただくこともできます。

CUT&RUNアッセイ製品はCSTの他の製品と同様、社内で厳格に検証されていますので、安心してお客様の実験にご利用いただけます。

カタログ番号 製品
86652 CUT&RUN Assay Kit
40366 CUT&RUN pAG-MNase and Spike-in DNA
14209 DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN)
88989 SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix
56795 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina®
47538 SimpleChIP®ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers)
29580 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers)
14654 12-Tube Magnetic Separation Rack
7017 6-Tube Magnetic Separation Rack

参考文献

  1. Skene PJ, et al. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. (2018) Nat. Protoc 13(5), 1006-1019. Pubmed 29651053
  2. Meers MP, et al. Improved CUT&RUN chromatin profiling and analysis tools. (2019) BioRxiv 1, 569129. bioRxiv 569129
  3. Skene PJ, and Henikoff S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. (2017) Elife 6, e21865. Pubmed 28079019
  4. Janssens DH, et al. Automated in situ chromatin profiling efficiently resolves cell types and gene regulatory programs. (2018) Epigenetics Chromatin 22(1), 74. Pubmed 30577869
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