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ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) の概要

ELISAとは

ELISA (酵素結合免疫吸着測定法) は、抗体を用いて標的分子を定量する、酵素免疫アッセイ (EIA) の一種です。抗体は、ペプチド、タンパク質、抗体、低分子などの標的分子を特異的に認識するために使われます。西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) などの酵素を抗体と直接的または間接的に共役させ、検出やシグナルの増幅に利用します。

ELISAの特徴として、溶液中のサンプルをシグナルを増幅しつつ検出する点が挙げられ、これが他の免疫アッセイと大きく異なります。

ELISA Cyclic AMP Assay Kit #4339

Cyclic AMP XP® Assay Kit #4339: Forskolin #3828で処理したCHO細胞で見られるcAMP濃度の上昇を、Cyclic AMP XP® Assay Kit #4339で検出しました。CHO細胞を4 x 104細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートしました。IBMXで前処理 (0.5 mM、30分間) した細胞と未処理細胞を、さらにForskolinで15分間処理し、1X Cell Lysis Buffer #9803で溶解しました。吸光度の値 (左) と% Activity (右) を示しました。% Activityは以下のように計算しました:% Activity=100x[(A-Abasal)/(Amax-Abasal)]、Aはサンプルの吸光度、Amaxは最大刺激 (すなわち高濃度のForskolin) の吸光度、Abasalは基底レベル (Forskolinなし) の吸光度です。Forskolinはアデニル酸シクラーゼを活性化し、細胞のcAMP濃度を上昇させます。IBMXはcAMPとcGMPホスホジエステラーゼの非特異的阻害剤で、産生されたcAMPやcGMPの加水分解を阻害してこれらの蓄積を促進します。

ELISAでできること

ELISAは細胞ライセート、組織ライセート、血清など様々なタイプのサンプルから、単一抗原 (あるいは特定の複数抗原) を認識して定量化する、簡便で確実性が高く、コスト効率の良い手法です。

ELISAは研究と診断の両方の用途によく利用される手法です。単一サンプルの試験にも利用できますが、スクリーニング用にハイスループットな実験系をデザインすることもできます。

ELISA PathScan® Phospho-Akt Sandwich ELISA #7252

PathScan® Phospho-Akt (Thr308) Sandwich ELISA Kit #7252 PDGF処理したNIH/3T3細胞と未処理コントロール細胞からライセートを調製し、これらを用いてタンパク質濃度と吸光度の関係を調べ、アッセイに最適なタンパク質濃度の検証しました。NIH/3T3細胞は血清飢餓処理した後 (85%コンフルエンス)、PDGF処理 (50 ng/mL、10分間、37°C) して溶解しました。

ELISA実験の手順

ELISAにはいくつかの種類があり、これによって実験の手順や操作に違いがあります。

実験操作は通常、抗原か捕捉抗体を吸着したマイクロウェルプレートで行います。標的抗原に結合する抗体を酵素標識し、この酵素を利用してシグナルを増幅します。

標識酵素の基質を加え、色の変化、蛍光、化学発光を検出して定量化します。

実験を成功させ信頼性の高いデータを得るためには、解析対象となる標的分子に特異性の高い抗体を使用することが重要です。特異性に加え、抗原に高い親和性をもつことも重要です。

ELISAが推奨される試験

ELISAは、抗体試薬の特異性とアッセイの簡便性により、生物学的サンプルの定量解析の究極的な判断基準の一つと考えられています。

ELISAは幅広い研究分野で利用することができ、診断用スクリーニングにも利用できます。Cell Signaling Technologyは、次のような研究分野でご利用いただけるELISAソリューションを提供しています。

  • リン酸化特異的タンパク質と総タンパク質の解析
  • 分泌タンパク質の発現
  • 翻訳後修飾 (PTM) の評価
  • 免疫学研究
  • 神経学研究
  • がん

解析結果に空間的な情報が必要な場合、ELISAは利用できません。

ウェスタンブロットと比較して、ELISAは定量性が高く、未変性の分子を検出することができます。

ELISA FastScan™ Total #67404 FastScan™ Phospho #42173

FastScan™ TotalとFastScan™ Phosphoの比較: A-431細胞をEGFで処理すると、p44/42 MAPK (Erk1/2) の総タンパク質量は変化しませんが、Thr202とTyr204のリン酸化が誘導されることが知られています。EGF処理したA-431細胞と未処理コントロール細胞からライセートを調製し、Erk1/2の総タンパク質量をFastScan™ Total p44/42 MAPK (Erk1/2) ELISA Kit #67404で解析しました。アッセイに用いたタンパク質の濃度と吸光度 (450 nm) の関係を左の図に示しました。
また、同様にライセートを調製し、Erk1/2のリン酸化のレベルをFastScan™ Phospho-p44/42 MAPK (Erk 1/2) (Thr202/Tyr204) ELISA Kit #42173で解析しました。アッセイに用いたタンパク質の濃度と吸光度 (450 nm) の関係を右の図に示しました。

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