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マルチプレックスIHC

豊富な社内検証と高度なテクニカルサポートにより、CSTのパラフィン切片免疫組織化学染色 (IHC-P) 検証済み抗体はすべて、蛍光マルチプレックスIHCに使用することができます。

マルチプレックスIHCの利点

  1. 限りある組織サンプルでは、組織切片ごとに最大限のデータを収集することが重要になります。
  2. 次世代シーケンシング、PCR、質量分析などでも、マルチプレックスアプローチは可能ですが、免疫組織化学染色の特長として、組織構造が保存された中で、標的の共発現と空間的構成の情報が得られることが挙げられます。
蛍光マルチプレックス免疫組織化学染色

扁桃腺のFFPEサンプルにおける、PD-L2 (橙)、PD-L1 (E1L3N®) (赤)、CD68 (緑)、PD-1 (黄)、CD8α (マゼンダ)、Pan-Keratin (シアン)。

複数の標的を同時に可視化できることは、様々な研究分野で重要であると言えます。例えば、腫瘍免疫学分野では、腫瘍微小環境内の免疫細胞のサブセットやがん細胞を分類することが必要になります。腫瘍は免疫チェックポイントタンパク質 (PD-1、CTLA-4、TIM-3など) の発現を変調し、活性化されたT細胞の「スイッチを切る」ことで、免疫システムを回避していると考えることができます。また、T細胞の消耗により、腫瘍細胞の除去効率が低下することがあります。この現象は、免疫チェックポイントタンパク質の発現の変化、VISTAのT細胞における発現、CD68+共浸潤マクロファージの出現によって特徴づけられます。このように、免疫チェックポイントタンパク質の分子プロファイリングと、免疫細胞の表現型の特定を組み合わせることが、複雑な腫瘍微小環境の理解に重要で、患者の個人差に配慮した複合医療の開発に繋がります。

マルチプレックスのオプション

mIHCマルチプレックスオプション

チラミドベースのマルチプレックスの利点：

  1. シグナル増幅：
    • 抗原の蛍光シグナルの顕著に増強します。
    • 存在量の少ない標的の検出が可能になります。
  2. シンプルなパネルデザイン：免疫動物種やアイソタイプに関わらず、あらゆるIHC-P検証済み抗体で使用可能です。
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チラミドは、触媒 (HRP) の存在下で活性化され、タンパク質抗原の表面または近傍に存在する電子の豊富な領域で、主にチロシン残基に共有結合する有機フェノールです (以下の模式図を参照してください)。HRPに触媒されるチラミド蛍光色素分子の沈着によって、抗原部位で蛍光シグナルが増幅されます。 

マルチプレックスIHCの図

チラミド‐チロシンは共有結合するため、熱処理によって、抗原に結合した蛍光シグナルを残しながら、一次抗体/二次抗体ペアの結合を除去 (ストリッピング) することができます。これによって、交差反応を心配することなく、同一の免疫動物種、アイソタイプの一次抗体を連続的に使用することが容易になり、マルチプレックス検出の可能性が大きく広がりました。

成功のために必要なもの

チラミドベースの蛍光mIHCには、以下のものが必要になります：

  1. IHC-Pに適用可能な、厳格に検証された高い特異性を持つ一次抗体 (Ab)。
    注意： CSTが提供するすべてのIHC-P検証済み抗体は、蛍光mIHCでお使いいただけます。
  2. 一次抗体の免疫動物種/アイソタイプに特異的な、チラミドの活性化と永続的な沈着を触媒する酵素であるHRPを標識した二次抗体。
    注意： HRPを直接標識した一次抗体も使用できます。
  3. チラミド蛍光標識。
  4. 3​種以上の標的と、1種類の核染色のmIHCパネルのためのマルチスペクトルカメラ。

抗体パネルのサイズ (用いる一次抗体の数) によって、イメージングシステムを選択する必要があります。

  • 従来のカメラで、小さなパネルサイズ (1-3標的/蛍光色素) のマルチプレックス解析においては、十分な分解能が得られます。マルチスペクトルカメラと、従来のカメラで撮られた広視野イメージの比較をご覧ください。 
マルチスペクトル vs. 従来型

PD-L1, CD3ε, CD8α Multiplex IHC Panel #65713：パラフィン包埋乳がん組織サンプルを、PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb #13684 (緑)、CD3ε (D7A6E) XP® Rabbit mAb #85061 (黄)、CD8α (C8/144B) Mouse mAb (IHC Specific) #70306 (赤) を用いて3重蛍光mIHCで解析しました。DAPI #8961 (蛍光DNA色素) は、青の擬似カラーで示しています。

  • 大きなパネルサイズ (4​つ以上の標的/蛍光色素) では、マルチスペクトルカメラが必須です。マルチスペクトルイメージングシステムの支援ソフトウェアで、励起/蛍光スペクトルにオーバーラップのある複数の蛍光色素 (および色素原) を区別して検出し、優れた分解能を持つマルチプレックス解析が可能になります。これは特に共発現解析を行う際は極めて重要です。

注意： 組織の自家蛍光による、蛍光IHCの感度の低下がしばしば問題になることがあります。これは、すべての蛍光イメージングプラットフォーム起こる問題です。マルチスペクトル解析ソフトウエアは、未染色組織の自家蛍光シグナルを相殺することで、この問題に対処しています。