BrdU Cell Proliferation Chemiluminescentプロトコール

A. 試薬の調製

1. BrdU ELISA Kitキットに含まれる20X Wash Bufferを精製水で希釈し、1X 洗浄バッファーを調製してください。
2. BrdU Detection AntibodyをDetection Antibody Diluent (緑色) で100倍希釈し、1X 検出抗体溶液を調製してください。
3. Anti-mouse IgG, HRP-linked AntibodyをHRP-linked Antibody Diluent (赤色) で100倍希釈し、1X HRP標識二次抗体溶液を調製してください。
4. BrdUを細胞培養液で100倍希釈し、10X BrdU溶液を調製してください。

B. BrdUの取り込み

1. 細胞を96-ウェルプレートに捲き込み、実験目的に応じて試験化合物等で処理してください。細胞増殖速度によりますが、典型的な播種細胞数は、2500–100000細胞/ウェルです。通常のインキュベーション時間は1–72時間です。
2. 調製した10X BrdU溶液をプレートのウェルに加え、最終濃度を1Xにしてください。（例：プレート内の100 µLの培地には、1ウェル当たり10X BrdU溶液10 µLを加えてください。)
3. 細胞をインキュベーターに入れてください。通常のインキュベーション時間は1–24時間です。
4. 培地を取り除いてください。浮遊細胞の場合、プレートを300 gで10分間遠心分離した後、培地を取り除いてください。

C. BrdUアッセイ

1. 100 µL/ウェルのFixing/Denaturing Solutionを加え、プレートを室温で30分間静置した後、溶液を除去してください。
2. 100 µL/ウェルの1X 検出抗体溶液を加え、プレートを室温に1時間静置してください。溶液を除去し、プレートを1X 洗浄バッファーで3回洗ってください。
3. 100 µL/ウェルの1X HRP標識二次抗体溶液を加え、プレートを室温に30分間置いてください。溶液を除去し、プレートを1X 洗浄バッファーで3回洗ってください。
4. Luminol/Enhancer SolutionとStable Peroxide Bufferを等量ずつ混合したワーキング溶液を調製してください。
5. ワーキング溶液100 µLを各ウェルに加えてください。プレート用ルミノメーターを用いて、基質を加えてから1–10分以内に、425​ nmでの相対発光量 (Relative Light Units : RLU) を測定してください。10分以内に測定した場合に至適なシグナル強度が得られます。