Caspase-3 Activity Assayプロトコール

A. 試薬の調製

1. Ac-DEVD-AMCをDMSO 1 mLに溶解してください。
2. 試薬 (DTT、Ac-DEVD-AMC) を実験直前に解凍してください。

注意：試薬を−20°Cで保存すると、沈殿が生じる可能性があります。沈殿物を溶解する場合は試薬を37°Cに温めてください。

3. Assay Buffer (2X) と精製水 (dH₂O) を等量ずつ混合し、DTT (200倍​希釈、最終濃度5 mM) を加え、1X アッセイバッファーAを調製してください。
4. Ac-DEVD-AMCを1X アッセイバッファーAで40倍希釈し、​基質溶液Bを調製してください。

B. 細胞ライセートの調製：96-ウェルプレートからのライセート回収

1. 1. 細胞を96-ウェルプレートに捲き込み、実験目的に応じて試験化合物等で適切な処理を行ってください。典型的な細胞数は、5 x 10⁴ – 2 x 10⁵細胞/ウェルです。
2. 処理後、プレートを300 x gで10分間遠心分離して、培地を取り除いてください。細胞を氷冷したPBSで洗浄し、プレートを300 x gで10分間遠心分離した後、PBSを取り除いてください。
3. Cell lysis buffer (#7018) を30 μL/ウェルで加え、プレートを氷上に​5分間静置してください。

注意：細胞ライセートプレートは、−80°Cで保存し、後で使用することができます

細胞培養ディッシュからのライセート回収

1. 実験目的に応じた細胞処理後、回収直前に細胞の接着具合を確認してください。細胞がプレートから剥がれるか緩くしか接着していなければ、ステップbに進み、細胞がプレートにしっかり接着していれば、ステップcに進んでください。
2. 培養中の培地で細胞を懸濁し、遠心チューブに回収してください。1000 x g cpmで5分間遠心分離して上清を除去し、 細胞ペレットにCell lysis buffer (#7018) を10 cm径プレート1枚当り0.5 mL加えてください。細胞が分散するように、ピペットで2、3回懸濁してください。氷上に静置し、ステップdに進んでください。
3. 氷冷したPBSで細胞を洗浄し、Cell lysis buffer (#7018) を10 cm径プレート1枚当たり0.5 mL加え、氷上に5分間静置してください。細胞をプレートから掻き取り、適切なチューブに移してください。氷上に静置し、ステップdに進んでください。
4. ライセートを氷上で超音波処理 (ソニケーション) してください。
5. 4°Cで10分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。アッセイ1回分ずつに分注し、-80℃で保存してください。

C. カスパーゼ活性アッセイ

1. 細胞ライセートを1X アッセイバッファーAで適切な濃度に希釈してください (0.5–4 mg/mLを推奨)。96-ウェルプレートから回収したライセートの場合は、希釈は必要ありません。
2. (オプション) キットに含まれるpositive control AMC 25 µLを1X アッセイバッファーA 200 μLと混ぜ合わせると、ポジティブコントロールとして使用できます。
3. 蛍光アッセイに適切な黒色プレートで、基質溶液B 200 µLとライセート溶液 25µLを混ぜ合わせてください。

注意：ライセートと基質溶液Bの混合後、速やかに測定を行い、0時間のタイミングのRFU値をで記録しておくことを推奨します。これにより、インキュベーション後にRFUに有意な変化があったかどうかを判断することができます。

注意：384-ウェルプレート形式でも同様のプロトコールで試験が可能です。液量をプレートの容量に応じて比例的に増減してください。例えば、384-低容量プレートを使用する場合、基質溶液B 20 µLとライセート 2.5 µLを使用してください。

4. プレートを37°C、暗所でインキュベートしてください。
5. 蛍光プレートリーダーを用いて、励起波長380 nm、蛍光波長420–460 nmでRFUを測定してください。

注意：1時間のインキュベーション後のプレート測定を推奨しています。シグナルが弱すぎる場合は、インキュベーション時間を増やしシグナル強度に有意な変化があるかどうか観察してください。シグナル強度に大きな変化が見られない場合は、ライセート量を増やすことで活性が確認できることがあります。