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ELISA-Peptide Assayプロトコール (ELISA-P)

A. 溶液および試薬

  1. 炭酸バッファー: 15 mM Na2CO3、35 mM NaHCO3、 0.2 g/L NaN3 (pH 9.6)。1 μMとなるように、合成ペプチドを加えた炭酸バッファーを使用してください。
  2. 10X Phosphate Buffered Saline (PBS): 1 Lを準備する場合は、塩化ナトリウム (NaCl) 80 g、塩化カリウム (KCl) 2 g、リン酸水素ナトリウム (Na2HPO4) 14.4 g、リン酸カリウム (KH2PO4) 2.4 gを精製水 (dH2O) 1 Lに溶解してください。pHを7.4に調整してください。
  3. ​洗浄バッファー:0.05% Tween® 20​含有1X PBS (PBST)
  4. ブロッキングバッファー:​10 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) を含むPBST
  5. 抗体希釈バッファー: 3% BSA含有PBST
  6. DELFIA® Europium-labeled Anti-mouse IgG (マウスの一次抗体用)、またはAnti-rabbit IgG (PerkinElmer Life Sciences #AD0124) (ラビットの一次抗体用)
  7. DELFIA® Enhancement Solution (PerkinElmer Life Sciences #1244-105)

B. プロトコール

  1. 96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに、1 μMで合成ペプチドを加えた炭酸バッファー溶液100 μLを加え、4°Cで一晩、もしくは37°Cで2​-6時間インキュベートすることにより、プレートにペプチドを固相化してください。もしペプチドが結合されない場合には、pH 4​-8の範囲の他のバッファーで試してください。
  2. 1ウェルあたり200 μLの洗浄バッファーでプレートを3回洗ってください。
  3. 1ウェルあたり​200 μLのブロッキングバッファーを加え37°Cで1時間インキュベートし、プレートをブロッキングしてください。洗浄バッファーでプレートを3回洗ってください。(必要に応じて、乾燥したプレートを4°Cで1-2ヵ月間保存することも可能です。)
  4. 抗体希釈バッファーで一次抗体を適切に希釈してください。ウェルに100 μLを加えて37°Cで1時間インキュベートしてください。
  5. 洗浄バッファーでプレートを3回洗ってください。
  6. DELFIA Europium-labeled Anti-mouse IgGが1ウェルあたり67 ng加えられるように抗体希釈用バッファーで希釈し、1ウェルあたり100​ μL加えてください。37°Cで30 分間インキュベートしてください。
  7. 洗浄バッファーで5回洗ってください。
  8. 100 μLのEnhancement Solutionを加え、37°Cで15分間インキュベートしてください。適切な時間分解プレートリーダーで615 nmの吸光度を測定してください。

更新:2005年6月

改訂日:2007年9月

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