ELISA-Peptide Assayプロトコール (ELISA-P)

A. 溶液および試薬

1. 炭酸バッファー： 15 mM Na₂CO₃、35 mM NaHCO₃、 0.2 g/L NaN₃ (pH 9.6)。1 μMとなるように、合成ペプチドを加えた炭酸バッファーを使用してください。
2. 10X Phosphate Buffered Saline (PBS)： 1 Lを準備する場合は、塩化ナトリウム (NaCl) 80 g、塩化カリウム (KCl) 2 g、リン酸水素ナトリウム (Na₂HPO₄) 14.4 g、リン酸カリウム (KH₂PO₄) 2.4 gを精製水 (dH₂O) 1 Lに溶解してください。pHを7.4に調整してください。
3. 洗浄バッファー： 1X PBS containing 0.05% Tween 20 (PBST)
4. ブロッキングバッファー：​10 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) を含むPBST
5. 抗体希釈バッファー： 3% BSA含有PBST
6. DELFIA Europium-labeled Anti-mouse IgG (マウスの一次抗体用)、またはAnti-rabbit IgG (PerkinElmer Life Sciences #AD0124) (ラビットの一次抗体用)
7. DELFIA Enhancement Solution (PerkinElmer Life Sciences #1244-105)

B. プロトコール

1. 96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに、1 μMで合成ペプチドを加えた炭酸バッファー溶液100 μLを加え、4°Cで一晩、もしくは37°Cで2​-6時間インキュベートすることにより、プレートにペプチドを固相化してください。もしペプチドが結合されない場合には、pH 4​-8の範囲の他のバッファーで試してください。
2. 1ウェルあたり200 μLの洗浄バッファーでプレートを3回洗ってください。
3. 1ウェルあたり​200 μLのブロッキングバッファーを加え37°Cで1時間インキュベートし、プレートをブロッキングしてください。洗浄バッファーでプレートを3回洗ってください。(必要に応じて、乾燥したプレートを4°Cで1-2ヵ月間保存することも可能です。)
4. 抗体希釈バッファーで一次抗体を適切に希釈してください。ウェルに100 μLを加えて37°Cで1時間インキュベートしてください。
5. 洗浄バッファーでプレートを3回洗ってください。
6. DELFIA Europium-labeled Anti-mouse IgGが1ウェルあたり67 ng加えられるように抗体希釈用バッファーで希釈し、1ウェルあたり100​ μL加えてください。37°Cで30 分間インキュベートしてください。
7. 洗浄バッファーで5回洗ってください。
8. 100 μLのEnhancement Solutionを加え、37°Cで15分間インキュベートしてください。適切な時間分解プレートリーダーで615 nmの吸光度を測定してください。