各製品専用-ELISAプロトコール：12923

次の製品の専用プロトコールです： PathScan^® Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit (Fluorescent Readout) #12923

A. 細胞ライセートの調製

1. 1X Cell Lysis Buffer (#7018) を解凍し、十分に混ぜ合わせてください。Protease Inhibitor Cocktail (100X) (#5871)を1X Cell Lysis Bufferに添加してください。Lysis Bufferは氷上に保持してください。
2. 培地を取り除き、細胞を氷冷した1X PBSで1回洗ってください。
3. PBSを取り除き、氷冷した1X Cell Lysis Bufferを加えてください。接着細胞には、各プレート (10 cm径) に1X Cell Lysis Buffer #7018 0.5 mLを使用してください。氷上で2分間インキュベートしてください。
4. ライセートを遠心分離用チューブへ移して、最大速度、4℃で2分間遠心分離してください。
5. 上清を新しいチューブに移してください。この上清が細胞ライセートです。ライセートはすぐに使用するか、1回分ずつに分注して-80℃で保存することができます。
6. アッセイを行なう直前に、ライセートをArray Diluent Bufferで0.2 – 1.0 mg/mLに希釈してください。使用するまで、氷上に保持してください。

B. アッセイ手順

1. 使用前に、ガラススライドとBlocking Bufferを室温に戻してください。
2. 20X Array Wash Bufferを脱イオン水で希釈して、1X Array Wash Bufferを調製してください (20X Array Wash Buffer 1 mLを脱イオン水 19 mLで希釈してください)。1X Array Wash Bufferとしてラベルしてください。希釈後は室温に保持してください。

3. 以下に従い、1X Detection Antibody Cocktailを調製してください：

   スライド1枚のみで実施する場合：10X Detection Antibody Cocktail 150μLをArray Diluent Buffer 1350 μLで希釈してください。

   スライド2枚で実施する場合：10X Detection Antibody Cocktail 300μLをArray Diluent Buffer 2700 μLで希釈してください。

4. 以下に従い、1X DyLight 680-linked Streptavidinを調製してください：

   スライド1枚のみで実施する場合：10X DyLight 680-linked Streptavidin 150 µLをArray Diluent Buffer 1350 µLで希釈してください。

   スライド2枚で実施する場合：10X DyLight 680-linked Streptavidin 300 µLをArray Diluent Buffer 2700 µLで希釈してください。

   *氷上に保持し、遮光してください。

5. マルチウェルガスケットをガラススライドに取り付けてください (下の図をご参照ください)：
   1. 実験台上に、マルチウェルガスケットを下向きにに置いてください (シリコンレイヤー側が上向きになります)。プラスティック保護フィルムを除去してください。
   2. ガラススライドを、ニトロセルロースパッド面を下に向け、ガスケットの開放部にパッドを合わせながら、マルチウェルガスケットの上に注意深く置いてください。スライドを垂直に向けた際に、目印の線が左上の隅に現れます。

   3. 金属クリップをガスケットの溝に挿入して、クリップをロック位置まで回転させてください。クリップが、スライドの目印の線と、同じ側に乗っていることを確認してください。

      注意：1つのクリップには上部の溝に小さな点が刻まれていて、パッドの印に合わせて組み上げることができます (スライドの組み上げ写真をご確認ください)。

   4. クリップを所定の位置までスライドさせてください。
   5. 同様に、マークされていないクリップを組み上げたもう一方の側にカチッとはめ込み、所定の位置までスライドさせます。
   6. アレイの組み立て準備が整いました。

6. Array Blocking Buffer 100 µLを各ウェルに加え、シーリングテープで覆って、オービタルシェーカー上で15分間、室温でインキュベートしてください。

   注意：ステップ14が終了するまでは、パッドが乾燥しないようにしてください。

7. Array Blocking Bufferを、液体を軽くはじき落とすようにしてシンクやその他適切な廃棄場所へ廃棄してください。希釈したライセート75 µLを各ウェルに加え、シーリングテープで覆ってください。オービタルシェーカー上で2時間、室温で (または一晩、4℃で) インキュベートしてください。
8. ウェル内の液体を軽くはじき落とすようにして、シンクやその他適切な廃棄場所へ廃棄してください。1X Array Wash Buffer 100 µLを各ウェルに加え、オービタルシェーカー上で5分間、室温でインキュベートしてください。この操作を3回繰り返してください。ウェル内の液体を廃棄してください。
9. 1X Detection Antibody Cocktail 75 µLを各ウェルに加え、シーリングテープで覆って、オービタルシェーカー上で1時間、室温でインキュベートしてください。

10. ステップ8と同様にして、1X Array Wash Buffer 100 µLで4​-5分間洗ってください。

    注意：この時点から、スライドを遮光してください。

11. 1X DyLight 680-Linked Streptavidin 75 µLを各ウェルに加え、シーリングテープで覆ってください。オービタルシェーカー上で30分間、室温でインキュベートしてください。
12. ステップ8と同様にして、1X Array Wash Buffer 100 µLで4​-5分間洗ってください。
13. 金属クリップの底部をスライドの中央から引っ張ることで、マルチウェルガスケットを取り外し、その後スライドとガスケットを別々に剥がしてください。
14. スライドを上向きにプラスティックディッシュ (清潔なピペットチップ箱の蓋など) 内に移し、脱イオン水 10 mLで10 秒間、一回洗ってください。
15. プラスティックディッシュからスライドを取り外して、完全に乾燥させてください。
16. 680 nmでの励起と700 nmでの蛍光検出が可能な蛍光デジタルイメージングシステムを使用して、スライドの画像を撮影してください。市販のアレイイメージング解析ソフトウェアを使用して、スポットの強度を定量してください。

DyLight is a registered trademark of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries.