BrdU染色用に改変済みのフローサイトメトリープロトコール

次の製品の専用プロトコールです： BrdU (Bu20a) Mouse mAb #5292

A. 溶液および試薬

1. 1X Phospate Buffered Saline (PBS)： NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na₂HPO₄ 1.44 g、KH₂PO₄​ 0.24 gを、精製水 (dH₂O) 800 mLに溶解してください。HClを用いてpHを7.4​​に調整し、精製水を加えて1 Lにしてください。室温で保存してください。
2. BrdU (5-Bromo-2′-deoxyuridine) EMD biosciences (Cat. #203806)
3. 100%および95%エタノール (無水変性、病理学グレード)
4. 1.5 M 塩酸
5. インキュベーションバッファー： Bovine Serum Albumin (BSA) 0.5 gを1X PBS 100 mLに溶解してください。4℃で保存してください。

B. BrdUの取り込みとサンプル調製

1. 暖めた新しい培地に終濃度が0.03 mg/mLになるようにBrdUを加えてください。使用するまで保温しておいてください。
2. 5,000万個程度の細胞を遠心分離によりチューブに集め、上清を吸引除去してください。
3. BrdUを含む培地2 mLを細胞ペレットに加え、ボルテックスし、37°Cで30分間インキュベートしてください。
4. 細胞を遠心分離により集め、培地を吸引除去してください。
5. 冷やした​70%エタノール2 mLを細胞ペレットに加えて、混ぜ合わせてください。
6. 細胞を室温で5分間固定してください。
7. PBS 2–3 mLの添加と遠心分離を3回繰り返し、細胞をよく洗ってください。
8. 1.5 M HClを加え、30分間室温でインキュベートしてください。
9. PBS 2–3 mLの添加と遠心分離を2回繰り返し、細胞をよく洗ってください。
10. 免疫染色に進んでください (セクションC)。

C. 免疫染色

注意：モノクローナル抗体にはアイソタイプを一致させたコントロールを、ポリクローナル抗体には免疫動物種を一致させたIgGコントロールを使用することを推奨します。細胞数を血球計算盤かその他の方法で計測してください。

1. ​​​0.5​-1 x 10⁶個の細胞をアッセイチューブに分注してください。
2. インキュベーションバッファー2​-3 mLを各チューブに加えて洗浄し、遠心分離で細胞を集めてください。繰り返す。
3. アッセイチューブごとに、インキュベーションバッファー100 μLで細胞を再懸濁してください。
4. 室温で10分間、インキュベーションバッファーでブロッキングしてください。
5. 適切に希釈された未標識の一次抗体をアッセイチューブに加えてください (推奨希釈率については抗体のデータシートを参照してください)。
6. 室温で1時間インキュベートしてください。
7. 前のステップと同様に、インキュベーションバッファーを加えて洗浄し、遠心分離にで細胞を集めてください。
8. 推奨希釈率に従ってインキュベーションバッファーに希釈した蛍光色素標識二次抗体*反応液で細胞を再懸濁してください。
9. 室温で30分間インキュベートしてください。
10. 前のステップと同様に、インキュベーションバッファーを加えて洗浄し、遠心分離にで細胞を集めてください。
11. 細胞をPBS 0.5 mLで再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。もしくは、DNA染色のため、ステップD1に進んでください。

D. DNA染色 (オプション)

1. 細胞を0.5 mLのDNA染色色素 (例、DRAQ5 #4084) で再懸濁してください。
2. 少なくとも5分間室温でインキュベートしてください。
3. DNA染色された細胞をフローサイトメーターで解析してください。

*推奨二次抗体:

抗マウス

• Anti-Mouse IgG (H+L)、F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4408
• Anti-Mouse IgG (H+L)、F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4409
• Anti-Mouse IgG (H+L)、F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4410