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フローサイトメトリー (FoxP3/転写因子の固定、透過化プロトコール)

A. 溶液および試薬

本プロトコールに必要なすべての試薬は、FoxP3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Kit #43481に含まれています。下に記載されているカタログ番号から、個別にお求めいただくこともできます。

  1. FoxP3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Diluent (1X) (#58766)
  2. FoxP3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate (4X) (#44931):FoxP3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Diluent (1X) で希釈し、必要な量の1Xワーキング溶液を調製してください。
  3. FoxP3/Transcription Factor Permeabilization Buffer (10X) (#68751):逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で希釈し、必要な量の1Xワーキング溶液を調製してください。すべての洗浄ステップと固定後の抗体のインキュベーションに使用します。

注意:実験に蛍光細胞染色色素 (生死判定色素、DNA色素など) を使用する場合は、色素の製品ページの推奨プロトコールを参照してください。フローサイトメトリーでの使用が検証済みの、細胞染色色素の一覧をご覧ください。

B. 固定と透過化

注意:接着細胞または組織は、固定の前に分散させ、単一細胞の懸濁液にしてください。全血を用いる場合は、固定の前にRBC Lysis Buffer (#46232) を使用して赤血球を溶解し、遠心分離で洗浄してください。

注意:固定の前に、Ghost Dye(TM) Violet 510 Viability Dye #59863などの生死判別色素を、色素の製品ページの推奨プロトコールに従って加えることができます。過剰な色素を除去してから、固定を続行してください。

注意:固定の前に、CDマーカーまたは他の細胞外エピトープを標的とする抗体を加えることができます。固定プロセスの間、抗体は目的とする標的に結合したままです。固定の前に洗浄ステップを実施できますが、必須ではありません。

注意:遠心分離の最適条件は、細胞のタイプと試薬の容量によって異なります。一般的には、150-300 gで1-5分間で細胞を十分にペレット化することができます。

  1. 遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去してください。
  2. 上に記載したように調製した、FoxP3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization 1Xワーキング溶液1 mLに細胞を再懸濁します。個々の細胞どうしがクロスリンクされないように、ペレットをよくほぐしてください。
  3. 室温 (20-25℃) で30-60分間インキュベートしてください。遮光してください。
  4. 過剰量の1X FoxP3/Transcription Factor/Permeabilization Buffer中で遠心分離して洗浄してください。上清を捨ててください。洗浄操作をもう一度繰り返してください。

C. 免疫染色

注意:細胞数を血球計算盤かその他の方法で計測してください。

  1. 必要な細胞数をチューブかウェルに分注してください。(通常、アッセイごとに5x105-1x106細胞です。)
  2. 1X FoxP3/Transcription Factor/Permeabilization Bufferで推奨通りに希釈した抗体100 µlで細胞を再懸濁してください。推奨希釈率は、個々の抗体のデータシートあるいはウェブの製品ページを参照するか、タイトレーションを行って決定してください。
  3. 室温 (20-25℃) で1時間インキュベートしてください。遮光してください。
  4. 過剰量の1X FoxP3/Transcription Factor/Permeabilization Buffer中で遠心分離して洗浄してください。上清を捨ててください。洗浄操作をもう一度繰り返してください。
  5. 蛍光標識一次抗体を使用する場合、1X FoxP3/Transcription Factor/Permeabilization Buffer 200-500 µlで細胞を再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。 標識されていない一次抗体については、次のステップに進んでください。
  6. 1X FoxP3/Transcription Factor/Permeabilization Bufferで推奨通りに希釈した蛍光標識二次抗体で細胞を再懸濁してください。
  7. 室温 (20-25℃) で30-60分間インキュベートしてください。遮光してください。
  8. 過剰量の1X FoxP3/Transcription Factor/Permeabilization Buffer中で遠心分離して洗浄してください。上清を捨ててください。洗浄操作をもう一度繰り返してください。
  9. 1X FoxP3/Transcription Factor/Permeabilization Buffer 200-500 µlで細胞を再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。
 
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