マウス脾T細胞のFoxP3び染色とフローサイトメトリープロトコール

次の製品の専用プロトコールです： FoxP3 (D6O8R) XP^® Rabbit mAb #12653

A. 溶液および試薬

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

• 20X Phospate Buffered Saline (PBS)： (#9808)：1X PBS 1 Lを調製する場合、20X PBS 50 mLを精製水 (dH₂O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
• ホルムアルデヒド (メタノール不含)
• 2%ホルムアルデヒド (PBS希釈液を実験日当日に用事調製してください)
• Triton X-100
• 1X ACK溶解バッファー​：NH₄C_l 8.29 g、KHCO₃ 1 g、EDTA 37.2 mgを溶解し、全量を1 Lにしてください。pHを7.2​-7.4に調整してください。4℃で保存してください。
• インキュベーションバッファー：Bovine Serum Albumin (BSA) (#9988) 0.5 gを、1X PBS 100 mLに溶解してください。4℃で保存してください。

B. 固定

注意：CD4抗体やCD25抗体による細胞表面の抗原の染色は、メーカーの推奨に従って、固定/透過化処理する前の生細胞で行ってください。

1. 100 μmのナイロンメッシュのセルストレイナーを使用して脾臓をバラバラにし、氷冷したPBSに集めてください。
2. 遠心分離により細胞を集め、ACK溶解バッファーで再懸濁して5分間静置してください。(赤血球の溶血)。
3. インキュベーションバッファーを加え、遠心分離により洗ってください。
4. チューブ1本あたり、単離された新鮮なマウス脾臓細胞5​-10​ x 10⁵​個をインキュベーションバッファー100 μLで再懸濁してください。
5. 遠心分離で細胞を集め、上清を吸引してください。
6. 細胞を2%ホルムアルデヒド500 μLに再懸濁してください。
7. 室温で15分間固定してください。
8. インキュベーションバッファーを加えて遠心分離し、2回洗ってください。

C. 透過化処理

1. 0.3% Triton X-100 (v/v in PBS) 1 mLを細胞ペレットに加えてください。
2. ボルテックスし、室温に30分間置いてください。
3. インキュベーションバッファーを加えて遠心分離し、2回洗ってください。

D. 免疫染色

1. 細胞ペレットをFoxP3 (D6O8R) XP^® Rabbit mAb #12653 の希釈液100 μLで再懸濁してください。 抗体希釈液は、インキュベーションバッファーを用いて1:200で希釈して調製してください。
2. 室温で1時間インキュベートしてください。
3. インキュベーションバッファーを加えて遠心分離し、2回洗ってください。
4. 蛍光色素標識一次抗体を用いた場合は、細胞をインキュベーションバッファー350 μLに再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。未標識一次抗体やビオチン化一次抗体を用いた場合はステップ5に進んでください。
5. インキュベーションバッファーを用いて推奨希釈率に希釈した蛍光標識二次抗体で細胞を再懸濁してください。
6. 室温で30分間インキュベートしてください。
7. インキュベーションバッファーを加えて遠心分離し、2回洗ってください。
8. 細胞をインキュベーションバッファー350 μLで再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。
9. CD4+ Tリンパ球でゲーティングすると、FoxP3とCD25の2パラメーターの散布図が得られます。