固相化した抗体を用いた免疫沈降プロトコール (ウェスタンブロッティングによる解析) (Immobilized IP)

A. 溶液および試薬

注意：Milli-Qまたは同等の精製水で溶液を調製してください。

1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS)
2. 1X Cell Lysis Buffer： 20 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mM Sodium pyrophosphate、1 mM β-glycerophosphate、1 mM Na₃VO₄、1 μg/mL Leupeptin。Cell Lysis Buffer (10X) (#9803)。

注意：CSTは、使用前に1 mM PMSFを加えることを推奨しています*。

3. 3X SDS sample buffer： 187.5 mM Tris-HCl (25°CでpH 6.8)、6% w/v SDS、30% グリセロール、150 mM DTT、0.03% w/v bromophenol blue。Blue Loading Buffer Pack (#7722)。

B. 細胞ライセートの調製

1. 培地を吸引してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
2. 未変性状態で細胞を回収する場合、培地を除去し、氷冷したPBSで細胞を1回洗ってください。
3. PBSを除去し、各プレート (10 cm径) 当たり氷冷した1X Cell Lysis Buffer (1 mM PMSF*を含む) を0.5 mL加え、氷上で5分間インキュベートしてください。
4. プレートから細胞を掻き取り、遠心分離用チューブに移してください。氷上に保持してください。
5. 氷上でサンプルを各5秒間、4回超音波処理してください。
6. 4°Cで10分間遠心分離して、上清を新しいチューブに移してください。必要に応じて、ライセートは–80°Cで保存することができます。

C. 免疫沈降

1. 細胞ライセート 200 μLに、固相化した抗体 10 µLを加えて、4°Cで一晩、穏やかに振盪しながらインキュベートしてください。
2. 4°Cで30秒間、遠心してください。ペレットを1X Cell Lysis Buffer 500 µLで5回洗ってください。洗いの操作は氷上で行ってください。
3. ペレットを3X SDSサンプルバッファー20 μLで再懸濁してください。ボルテックスした後、30秒間遠心分離してください。
4. サンプルを95-100°Cで2-5分間加熱してください。
5. サンプル (15-30 µL) をSDS-PAGEゲル (12–15%) にロードしてください。
6. ウェスタンブロッティングでサンプルを解析してください (ウェスタンブロッティングプロトコールを参照してください)。