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免疫蛍光染色プロトコール (IF Standard)

重要:この製品が培養細胞 (IF-IC)、パラフィン包理切片 (IF-P) あるいは凍結組織切片 (IF-F) を用いた免疫蛍光染色で使用可能であるかについては、データシートまたは製品ウェブページの最初のページにあるApplicationセクションをご参照ください。適切な抗体希釈率および抗原賦活化溶液は、製品ウェブページをご覧ください。このプロトコールは非標識抗体および蛍光標識抗体の両方での使用をお勧めします。

注意:一部のCST™抗体は、本項記載のものとは別のプロトコールを使った場合に最適化されます。各製品の推奨条件は製品ウェブページのプロトコールをご覧ください。

A. 溶液および試薬

効率的でお得な調製済み試薬が入った#12727 Immunofluorescence Application Solutions Kitを使用して、質の高い免疫蛍光染色画像データを取得しましょう。

注意:溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phospate Buffered Saline (PBS): (#9808):1X PBS 1 Lを調製する場合、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。注意:pHを8.0に調整してください。
  2. ホルムアルデヒド:16%、メタノール不含、Polysciences社製 (Cat#18814) を推奨します。新しいホルムアルデヒドを使用してください。開封後は、暗所、4°Cで保存してください。1X PBSで4倍に希釈し、4%ホルムアルデヒドを調製してください。
  3. ブロッキングバッファー:(1X PBS/5%正常血清/0.3% Triton™ X-100):10 mLを用意する場合は、二次抗体の免疫動物と同種の正常血清0.5 mLを加えて (例:Normal Goat Serum (#5425) を9.5 mLの1X PBSに加える) よく混ぜ合わせてください。スターラーで撹拌しながら、Triton™ X-100 30 µLを加えてください。
  4. 抗体希釈バッファー:(1X PBS/1% BSA/0.3% Triton™ X-100):10 mLを用意する場合は、Triton™ X-100 30 µLを1X PBS 10 mLに加えてよく混ぜ合わせてください。混ぜ合わせた後、BSA (#9998) 0.1 gを加えてよく混ぜ合わせてください。
  5. 蛍光標識二次抗体:Anti-mouse (#4408#4409#8890#4410)、Anti-rabbit (#4412#4413#8889#4414)、Anti-rat (#4416#4417#4418)
  6. Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071)、Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961)

B. 試料作製

I. 培養細胞株 (IF-IC)

注意:マルチウェルプレート、チェンバースライドあるいはカバーガラス上で直接細胞を培養、薬剤処理、固定および染色してください。

  1. 溶液を吸引除去し、細胞が2-3 mm浸るように4%ホルムアルデヒド (温めたPBSで希釈) を加えてください。

    注意:ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフト内でのみ使用してください。

  2. 細胞を室温で15分間固定してください。
  3. 固定液を吸引除去し、1X PBSで各5分間、3回すすいでください。
  4. 免疫染色操作に進んでください (セクションC)。

II. 凍結/クリオスタット切片 (IF-F)

  1. 固定済み凍結組織切片の場合、免疫染色操作に進んでください (セクションC)。
  2. 未固定の凍結組織切片の場合、下記手順ですぐに固定してください。
    1. 温めた1X PBSで希釈した4%ホルムアルデヒドで切片を覆ってください。
    2. 切片を室温で15分間固定してください。
    3. PBSでスライドを各5分間、3回すすいでください。
    4. 免疫染色操作に進んでください (セクションC)。

C. 免疫染色

注意:指定がない限り、乾燥と蛍光色素退色の防止のため、免疫染色のすべてのインキュベーションは遮光湿潤箱中、または蓋付きのディッシュ/プレート中で、室温で行ってください。

  1. ブロッキングバッファーでサンプルを60分間ブロッキングしてください。
  2. ブロッキングしている間に、一次抗体を抗体希釈バッファーで、データシートに記載の希釈率に希釈してください。
  3. ブロッキング液を吸引除去し、希釈した一次抗体を加えてください。
  4. 4℃で一晩インキュベートしてください。
  5. 1X PBSで各5分間、3回すすいでください。

    注意:蛍光標識された一次抗体を使用する場合は、セクションC、ステップ8に進んでください。

  6. 抗体希釈バッファーで希釈した蛍光標識二次抗体をアプライし、遮光して室温で1-2時間インキュベートしてください。
  7. 1X PBSで各5分間、3回すすいでください。
  8. 切片をProlong® Gold Antifade Reagent (#9071)、あるいはProlong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) とカバーガラスで覆ってください。
  9. 最良の結果を得るために、封入剤を室温で一晩硬化させてください。スライドを長期保存する際は、4°C、暗所で、水平にして保存してください。

更新:2006年11月

改訂日:2016年7月

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