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メタノール透過化処理の免疫蛍光染色プロトコール (IF Methanol-Perm)

重要: 製品が培養細胞 (IF-IC)、パラフィン包埋切片 (IF-P) あるいは凍結組織切片 (IF-F) で使用可能かあるかについては、データシートの最初のページのApplicationsセクションをご参照ください。

A. 溶液および試薬

注意:溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

  • 20X Phospate Buffered Saline (PBS) (#9808): 1X PBS 1 Lを用意する場合:20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。注意:pHを8.0に調整してください。
  • ホルムアルデヒド、16%、メタノール不含、Polysciences, Inc. (cat# 18814)、新しい物を使用し、開封した瓶は暗所で4°Cで保存し、使用の際はPBSで希釈してください。1X PBSで4倍に希釈し、4%ホルムアルデヒドを調製してください。
  • メタノール、100%
  • ブロッキングバッファー (1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100):
    10 mLを用意する場合は、二次抗体の免疫動物と同種の正常血清0.5 mLを加えて (例:Normal Goat Serum (#5425) を9.5 mLの1X PBSに加える) よく混ぜ合わせてください。スターラーで撹拌しながら、Triton™ X-100 30 µLを加えてください。
  • 抗体希釈バッファー (1X PBS/1% BSA/0.3% Triton™ X-100):
    10 mLを用意する場合は、Triton™ X-100 30 µLを1X PBS 10 mLに加えてよく混ぜ合わせてから、混ぜ合わせた後、BSA (#9998) 0.1 gを加えてよく混ぜ合わせてください。
  • 蛍光標識二次抗体:
    Anti-mouse (#4408#4409#8890#4410)、Anti-rabbit (#4412#4413#8889#4414)、Anti-rat (#4416#4417#4418)
  • Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)、Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 試料作製

I. 培養細胞株 (IF-IC)

注意:マルチウェルプレート、チェンバースライドあるいはカバースリップ上で直接細胞を培養、処理、固定および染色してください。

  1. 培地を吸引除去し、4%ホルムアルデヒド (PBSで希釈) を細胞が2~3 mm浸る程度に加えてください。
    注意:ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフト内でのみ使用してください。
  2. 細胞を室温で15分間固定してください。
  3. 固定液を吸引除去し、PBSで各5分間、3回洗ってください。
  4. 免疫染色操作に進んでください (セクションC)。

II. 凍結/クリオスタット切片 (IF-F)

  1. 固定済み凍結組織切片の場合、免疫染色操作に進んでください (セクションC)。
  2. 作製したての未固定の凍結切片の場合は、下記方法で直ちに固定してください。
    1. PBSで希釈した4%ホルムアルデヒドで切片を覆ってください。
      注意:ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフト内でのみ使用してください。
    2. 切片を室温で15分間固定してください。
    3. PBSでスライドを各5分間、3回洗ってください。
    4. 免疫染色操作に進んでください (セクションC)。

C. 免疫染色

注意:指定がない限り、乾燥と蛍光色素退色の防止のため、免疫染色のすべてのインキュベーションは遮光湿潤箱中、または蓋付きのディッシュ/プレート中で、室温で行ってください。

  1. メタノール透過化処理のステップ:細胞あるいは組織切片を氷冷した100%メタノールで覆い (3~5 mmまでが完全に浸る程の十分量のメタノールを使用し、絶対に乾かさないでください)、メタノール中で-20°C、10分間インキュベートし、PBSで5分間すすいでください。
  2. ブロッキングバッファーでサンプルを60分間ブロッキングしてください。
  3. ブロッキングしている間に、データシートの記載に従って一次抗体を抗体希釈バッファーで希釈してください。
  4. ブロッキング液を吸引除去し、希釈した一次抗体を加えてください。
  5. 4℃で一晩インキュベートしてください。
  6. PBSで各5分間、3回洗ってください。
    注意:蛍光標識された一次抗体を使用する場合は、セクションC、ステップ8に進んでください。
  7. 抗体希釈バッファーで希釈した蛍光標識二次抗体を加え、遮光して室温で1 - 2時間インキュベートしてください。
  8. ステップ6と同様にPBSで洗ってください。
  9. 切片をProlong® Gold Antifade Reagent (#9071)、あるいはProlong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) とカバーガラスで覆ってください。
  10. 最良の結果を得るために、直ちに適切な励起波長で染色像を観察してください。スライドを長期保存する際は、4°C、暗所で水平にして保存してください。

更新:2006年11月

改訂日:2016年7月

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