免疫組織化学染色プロトコール (凍結組織切片) -製品専用プロトコール：4060

次の製品の専用プロトコールです： Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP^® Rabbit mAb #4060

A. 溶液および試薬

1. キシレン
2. エタノール (無水変性、病理学グレード 100%および95%)。
3. ヘマトキシリン (オプション)
4. 固定液：
   1. メタノール
   2. 16%ホルムアルデヒド
      1. 3%ホルムアルデヒド：調製する場合は、16%ホルムアルデヒド18.75 mLを1X PBS 81.25 mLに加えてください。
5. 10X Tris Buffered Saline (TBS) 1 Lを調製する場合は、Trizma ​base (C₄H₁₁NO₃) 24.2 gと塩化ナトリウム (NaCl) 80 gを、精製水 (dH₂O) 1Lに加えてください。HClでpHを7.6に調整してください。
6. 洗浄バッファー： 1X Tris Buffered Saline (TBS) 1 Lを調製する場合は、10X TBS 100 mLを精製水 (dH₂O) 900 mLにを加えてください。
7. メタノール/ペルオキシダーゼ：調製する場合は、30%過酸化水素水₂0₂10 mLをメタノール90 mLに加えてください。-20℃で保存してください。
8. ブロッキング液： 1X TBS/0.3% Triton-X 100/5% Normal Goat Serum (#5425)。​調製する場合は、 1X TBS 9.5 mLに正常ヤギ血清 500 µLとTriton-X 100​ 30 µLを加えてください。
9. SignalStain^® Antibody Diluent (#8112)
10. SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) (#8114)
11. DAB試薬または適切な基質： メーカーの推奨に従って調製してください。

B. 切片作製

1. -80℃で保存した組織の場合：切片を作製する前にフリーザーから取り出し、-20℃で約15分間平衡化してください。これにより切片作製時のブロックの亀裂を防ぐことができます。
2. 6​ - 8 µmの範囲で組織を薄切し、正に帯電したスライドに貼り付けてください。
3. 固定する前に切片を数分間実験台で風乾してください (これによりスライドへ切片を接着させます)。

C. 固定

1. スライド上の切片を乾かした後、下記の手順で固定してください。
   1. 3%ホルムアルデヒド/メタノール：3%ホルムアルデヒドに室温で15分間浸漬した後、メタノールに-20℃で5分間浸漬してください (この間に洗浄操作は不要です)。すぐに染色操作へ進んでください。

D. 染色

1. 洗浄バッファーで切片を各5分間、2回洗ってください。
2. メタノールで希釈した3% H₂0₂で10分間、室温でインキュベートしてください。
3. 洗浄バッファーで切片を各5分間、2回洗ってください。
4. ブロッキング液で各切片を室温で1時間ブロッキングしてください。
5. ブロッキング液を除去し、希釈した一次抗体100 - 400 µLを各切片に加えてください。(抗体の希釈はSignalStain^® Antibody Diluent #8112で行ってください)。4℃で一晩インキュベートしてください。
   *製品のデータシート​で推奨希釈率を確認してください。
6. 抗体液を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください。
7. SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114で、検出してください。切片をSignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114に浸し、加湿チャンバー内で、室温で30分間インキュベートしてください。
8. SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください。
9. DABまたは適切な基質 100​ - 400 µLを各切片に加え、発色を注意深く観察してください。
10. 切片の発色が進んだらすぐに、スライドを精製水 (dH₂O) に浸してください。
11. 必要に応じて、メーカーの指示に従ってヘマトキシリンで切片を対比染色してください。
12. 精製水 (dH₂O) で切片を各5分間ずつ、2回洗ってください。
13. 切片を脱水してください：
    1. 95%エタノールで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
    3. キシレンで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
14. カバーガラスで封入してください。