*重要:適切な抗体希釈率については製品データシートを参照してください。
A. 溶液および試薬
- キシレン
- エタノール、無水変性、病理学グレード (100%および95%)
- 精製水 (dH2O)
- ヘマトキシリン (オプション)
- 洗浄バッファー:
1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST): 1 Lを調製する場合は、10X TBS 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加えてください。Tween-20 1 mLを加え、混ぜ合わせてください。
10X Tris Buffered Saline (TBS) 1 Lを調製する場合は、Trizma base (C4H11NO3) 24.2 gと塩化ナトリウム (NaCl) 80 gを、精製水 (dH2O) 1 Lに加えてください。HClでpHを7.6に調整してください。 - 抗体希釈液: SignalStain® Antibody Diluent #8112
- 抗原賦活化:EDTA:1 mM EDTA:1 Lを調製する場合は、EDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 0.372 gを精製水 (dH2O) 1 Lに加えてください。pHを8.0に調整してください。
- 3%過酸化水素水:調製する場合は、30% H2O2 10 mLを精製水 (dH2O) 90 mLに加えてください。
- ブロッキング液: TBST/5% Normal Goat Serum (#5425):1X TBST 5 mLにNormal Goat Serum 250 μLを加えてください。
- EnVision+ HRP, Rabbit (Dako North America, Inc. Carpinteria, CA #K4003)
- DAB試薬または適切な基質: メーカーの推奨に従って調製してください。
B. 脱パラフィン/再水和
注意:操作の間は、スライドを乾燥さないようにご注意ください。
- 切片の脱パラフィン/水和:
- キシレンで切片を各5分間、3回インキュベートしてください。
- 100%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
- 95%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
- 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、2回洗ってください。
C. 抗原賦活化
注意:この手順は、Decloaking Chamber (Biocare Medical社) を用いて最適化されています。他の抗原賦活化装置では、設定や操作方法が異なります。
- 室温の抗原賦活化用EDTAバッファー250 mLが入った24スライド用ホルダーにスライドを入れてください。
- 精製水 (dH2O) 500 mLを圧力釜に注ぎ入れてください。
- スライドホルダーをヒートシールドの上に乗るよう自動抗原賦活化装置 (圧力釜) 内に置いてください。ブランクのスライドと精製水250 mLが入った24枚用スライドホルダーも圧力釜に入れておくことをお勧めします。
- 蓋を閉めて、賦活化を進めてください。Decloaking Chamberの設定は以下のようにしてください。
- SP1 125°C 30秒間
- SP2 90°C 10秒間
- 慎重に蒸気を抜き、フタを開けて、スライドを実験台の上で10分間冷却してください。
- スライドを精製水 (dH2O) で洗ってください。
D. 染色
- 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、3回洗ってください。
- 3%過酸化水素水で切片を10分間インキュベートしてください。
- 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、2回洗ってください。
- 洗浄バッファーで切片を5分間洗ってください。
- ブロッキング液100-400 μLを各切片に加え、室温で1時間ブロッキングしてください。
- ブロッキング液を除去し、SignalStain®Antibody Diluent #8112で希釈した一次抗体100-300 μLを各切片に加えてください。4℃で一晩インキュベートしてください。製品のデータシートで推奨希釈率を確認してください:2085、 3197。
- EnVision+試薬を室温に戻してください。
- 抗体を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間ずつ、3回洗ってください。
- 1-2滴のEnVision+を各切片に添加してください。室温で30分間インキュベートしてください。
- EnVision+溶液を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間ずつ、3回洗ってください。
- DABまたは適切な基質100-400 µLを各切片に加え、発色を注意深く観察してください。
- 十分に発色したら、スライドを精製水 (dH2O) に浸してください。
- 必要に応じて、メーカーの指示に従ってヘマトキシリンで切片を対比染色してください。
- 精製水 (dH2O) で切片を各5分間ずつ、2回洗ってください。
- 切片を脱水してください:
- 95%エタノールで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
- 100%エタノールで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
- キシレンで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
- カバーガラスで封入してください。