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免疫組織化学染色プロトコール (凍結切片) - SignalStain® Boost Detection Reagent

*重要:製品が凍結組織切片 (IHC-F) で検証され使用が承認されているかどうかについては、製品ウェブページで確認してください。適切な抗体希釈率および抗原賦活化溶液は、製品ウェブページをご覧ください。

注意:各製品の推奨条件は製品ウェブページをご覧ください。

A. 溶液および試薬

注意:溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

  1. キシレン
  2. エタノール (無水変性、病理学グレード 100%および95%)。
  3. ヘマトキシリン (オプション)
  4. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS) (#9808):1X PBS 1 Lを調製する場合、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  5. 固定液:最適な固定液は、製品のデータシートを参照してください。
    1. 10%中性緩衝ホルマリン
    2. アセトン
    3. メタノール
    4. 3%ホルムアルデヒド:100 mLを用意する場合は、1X PBS 81.25 mLに16%ホルムアルデヒド18.75 mLを加えてください。
  6. 10X Tris Buffered Saline (TBS) 洗浄バッファー:(#12498) 1X TBS 1 Lを用意する場合は、10X TBS 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  7. メタノール/ペルオキシダーゼ:30%過酸化水素水 (H2O2) 10 mLをメタノール90 mLに加えてください。-20℃で保存してください。
  8. ブロッキング液:1X TBS/0.3% Triton™ X-100/5% Normal Goat Serum (#5425)。1X TBS 9.5 mLに正常ヤギ血清500 µLとTriton™ X-100 30 µLを加えてください。
  9. 検出システム:SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP標識マウス用 #8125、HRP標識ウサギ用 #8114)
  10. 基質:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)

B. 切片作製

  1. 組織は-80℃で保存してください:切片を作製する前に冷凍庫から取り出し、-20℃で約15分間平衡化してください。これにより切片作製時のブロックの亀裂を防ぐことができます。
  2. 6-8 µmの範囲で組織を薄切し、正に帯電したスライドに貼り付けてください。
  3. 固定する前に切片を数分間実験台で風乾してください (これにより切片のスライドへの接着が促進されます)。

C. 固定

注意:最適な固定液は、製品のデータシートを参照してください。

  1. スライド上で切片が乾いたことを確認し、下記の手順で最適な固定液で固定してください。
    1. 10%中性緩衝ホルマリン:室温で10分間浸漬してください。すぐに染色操作Dへ進んでください。
    2. 冷アセトン:-20°Cで10分間浸漬してください。その後風乾してください。すぐに染色操作Dに進んでください。
    3. メタノール:-20°Cで10分間浸漬してください。すぐに染色操作Dに進んでください。
    4. 3%ホルムアルデヒド:室温で15分間浸漬してください。すぐに染色操作Dに進んでください。
    5. 3%ホルムアルデヒド/メタノール:3%ホルムアルデヒドに室温で15分間浸漬した後、メタノールに-20℃で5分間浸漬してください (途中ですすがないでください)。すぐに染色操作Dに進んでください。

D. 染色

  1. 洗浄バッファーで切片を各5分間、2回洗ってください。
  2. メタノール/ペルオキシダーゼで、室温、10分間インキュベートしてください。
  3. 洗浄バッファーで切片を各5分間、2回洗ってください。
  4. ブロッキング液100-400 µLで各切片を室温で1時間ブロッキングしてください。
  5. ブロッキング液を除去し、推奨希釈率で希釈した一次抗体100-400 µLを各切片に添加してください。
  6. 4℃で一晩インキュベートしてください。
  7. SignalStain® Boost Detection Reagentを室温に戻してください。
  8. 抗体液を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください
  9. 切片を覆うようにSignalStain® Boost Detection Reagentを滴下 (1-3滴) してください。加湿チャンバー内 (室温) で30分間インキュベートしてください。
  10. 洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください。
  11. 使用前にSignalStain® DAB Chromogen Concentrate 1滴 (30 µL) をSignalStain® DAB Diluent 1 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  12. 調製したSignalStain® DAB溶液 100-400 µLを各切片に加え、注意深く観察してください。通常は1-10分間で十分な染色強度が得られます。
  13. スライドを精製水 (dH2O) に浸してください。
  14. 必要に応じて、製造元の指示に従い、ヘマトキシリンで切片を対比染色してください。
  15. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、2回洗ってください。
  16. 切片を脱水してください:
    1. 95%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    3. キシレンで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
  17. 切片をカバーガラスで封入してください。

更新:2010年2月

改訂日:2013年11月

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