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免疫組織化学染色プロトコール (パラフィン切片) - SignalStain® Boost Detection Reagent

重要:製品がパラフィン包埋組織切片 (IHC-P) で検証され使用が承認されているかどうかについては、製品データシートの上部にあるApplicationsの項目、あるいは製品ウェブページで確認してください。

注意:適切な抗体希釈率、希釈液、抗原賦活化溶液は製品ウェブページをご覧ください。

A. 溶液および試薬

注意:溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

  1. キシレン
  2. エタノール、無水変性、病理学グレード (100%および95%)
  3. 脱イオン水 (dH2O)
  4. 洗浄バッファー
    1. 1X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST):1X TBST 1 Lを用意する場合は、10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST) (#9997) 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  5. 抗体希釈液:
    1. SignalStain® Antibody Diluent:(#8112)
    2. 5%正常ヤギ血清含有TBST:1X TBST 5 mLにNormal Goat Serum (#5425) 250 µLを加えてください。
    3. 5%正常ヤギ血清含有PBST:1X PBST 5 mLにNormal Goat Serum (#5425) 250 µLを加えてください。
      • 1X PBST:1X PBST 1 Lを用意する場合は、20X Phosphate Buffered Saline with Tween® 20 (PBST) (#9809) 50 mLと精製水 (dH2O) 950 mLを加え、混ぜ合わせてください。
  6. 抗原賦活化液:
    1. 1X クエン酸賦活化液:1X クエン酸賦活化液250 mLを用意する場合は、SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 25 mLを精製水 (dH2O) 225 mLで希釈してください。
    2. 1X EDTA賦活化液:1X EDTA賦活化液250 mLを用意する場合は、SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) (#14747) 25 mLを精製水 (dH2O) 225 mLで希釈してください。
    3. TE:10 mM Tris/1 mM EDTA、pH 9.0:1 Lを用意する場合は、Tris base (C4H11NO3) 1.21 gとEDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 0.372 gを、精製水 (dH2O) 950 mLに加えてください。pHを9.0に調整して、精製水 (dH2O) で全量を1 Lにしてください。
    4. ペプシン:1 mg/mLでTris-HCl (pH 2.0) に溶解してください。
  7. 3%過酸化水素:100 mLを用意する場合は、30%過酸化水素水 (H2O2) 10 mLを精製水 (dH2O) 90 mLに加えてください。
  8. ブロッキング液:1X TBST/5%正常ヤギ血清または1X Animal-Free Blocking Solution
    1. 1X TBST/5%正常ヤギ血清:1X TBST 5 mLにNormal Goat Serum (#5425) 250 µLを加えてください。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution:精製水 (dH2O) 4 mLに、Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019) 1 mLを加えてください。
  9. 検出システム:SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP標識マウス用 #8125、HRP標識ウサギ用 #8114)
  10. 基質:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)
  11. ​ヘマトキシリン:Hematoxylin (#14166)
  12. 封入剤:SignalStain® Mounting Medium (#14177)

B. 脱パラフィン/再水和

注意:操作の間は、スライドを乾燥さないようにご注意ください。

  1. 切片の脱パラフィン/水和:
    1. キシレンで切片を各5分間、3回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
    3. 95%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
  2. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、2回洗ってください。

C. 抗原賦活化

注意:抗原賦活化液およびその手順は製品により推奨が異なりますので、製品データシートを参照してください。

  1. クエン酸の場合:スライドを1X クエン酸賦活化液に入れ、電子レンジで沸騰が始まるまで加熱してください。その後沸騰直前の温度 (95°-98°) を10分間維持してください。スライドを実験台で30分間冷却してください。
  2. EDTAの場合:スライドを1X EDTA賦活化液に入れ、電子レンジで沸騰が始まるまで加熱してください。その後沸騰直前の温度 (95°-98°) で15分間維持してください。その後の冷却は必要ありません。
  3. TEの場合:スライドを10 mM Tris/1 mM EDTA、pH 9.0に入れ、電子レンジで沸騰が始まるまで加熱してください。その後沸騰直前の温度 (95°-98°) で18分間維持してください。スライドを実験台で30分間冷却してください。
  4. ペプシンの場合:37℃で10分間切片を処理してください。

D. 染色

注意:推奨の抗体希釈液は、製品データシートを参照してください。

  1. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、3回洗ってください。
  2. 3%過酸化水素で切片を10分間インキュベートしてください。
  3. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、2回洗ってください。
  4. 洗浄バッファーで切片を5分間洗ってください。
  5. 各切片を推奨ブロッキング液100-400 µLで室温で1時間ブロッキングしてください。
  6. ブロッキング液を除去し、推奨抗体希釈液で希釈した一次抗体100-400 µLを各切片に加えてください。
  7. 4℃で一晩インキュベートしてください。
  8. SignalStain® Boost Detection Reagentを室温に戻してください。
  9. 抗体液を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください。
  10. 切片を覆うようにSignalStain® Boost Detection Reagentを滴下 (1-3滴) してください。加湿チャンバー内 (室温) で30分間インキュベートしてください。
  11. 洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください。
  12. 使用前にSignalStain® DAB Chromogen Concentrate 1滴 (30 µL) をSignalStain® DAB Diluent 1 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  13. 各切片に調製したSignalStain® DAB溶液 100-400 µLを添加し、注意深く観察してください。通常、1-10分間で十分な染色強度が得られます。
  14. スライドを精製水 (dH2O) に浸してください。
  15. 必要に応じて、使用説明書に従い、切片をHematoxylin (#14166) で対比染色してください。
  16. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、2回洗ってください。
  17. 切片を脱水してください:
    1. 95%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    3. キシレンで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
  18. 切片をSignalStain® Mounting Medium (#14177) とカバーガラスで封入してください。

更新:2010年2月

改訂日:2016年10月

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