このプロトコールは、未変性タンパク質を免疫沈降し、ウェスタンブロッティングやキナーゼ活性による解析を行う場合にご使用いただけます。#73778 Protein A Magnetic Beadsあるいは#70024 Protein G Magnetic Beadsを使用する場合は、磁気分離の免疫沈降プロトコールをご参照ください。
A. 溶液および試薬
注意:溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。
- 20X Phospate Buffered Saline (PBS): (#9808) 1X PBSを1 L用意する場合は、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
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10X Cell Lysis Buffer:(#9803) 1X Cell Lysis Bufferを10 mL用意する場合は、10X Cell Lysis Buffer 1 mLを精製水 (dH2O) 9 mLに加え、混ぜ合わせてください。
注意:使用直前に1 mM PMSF (#8553) を加えてください。
- 3X SDSサンプルバッファー:Blue Loading Pack (#7722) またはRed Loading Pack (#7723)。1/10容量の30X DTTを3X SDSローディングバッファーに加え、還元作用を持つ新しい3X ローディングバッファーを調製してください。
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Protein AまたはGアガロースビーズ (非標識一次抗体用):ラビットIgGの免疫沈降にはProtein A (#9863) を、マウスIgGの免疫沈降にはProtein G (#37478) を使用してください。
- ビーズ標識ストレプトアビジン (ビオチン化抗体用):(#3419) バイアルを静かにボルテックスし、免疫沈降1回につき10 µL使用してください。
- 10X Kinase Buffer (キナーゼアッセイ用):(#9802) 1X Kinase Bufferを1 mL用意する場合は、10X Kinase Buffer 100 µLを精製水 (dH2O) 900 µLに加えて、混ぜ合わせてください。
- ATP (10 mM) (キナーゼアッセイ用):(#9804) ATP (200 µM) 0.5 mLを用意する場合は、ATP (10 mM) 10 µLを1X Kinase Buffer 490 µLに加えてください。
B. 細胞ライセートの調製
- 培地を吸引してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
- 未変性状態で細胞を採取するために、培地を除去し、氷冷した1X PBSで細胞を1回洗ってください。
- PBSを除去し、各プレート (10 cm) に氷冷した1X Cell Lysis Buffer 0.5 mLを加え、氷上で5分間インキュベートしてください。
- プレートから細胞を掻き取り、遠心分離用チューブに移してください。氷上に保持してください。
- 氷上で超音波処理を3回 (各5秒間) 行なってください。
- 4°C、14,000 x gで10分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。必要に応じて、ライセートは-80°Cで保存することができます。
C. 免疫沈降
細胞ライセートのプレクリア (非標識およびビオチン化抗体用のオプションステップ)
重要:一次抗体の免疫沈降で特異的な結合を確認するために、適切なアイソタイプコントロールの使用を強くお勧めします。ラビットポリクローナル一次抗体にはNormal Rabbit IgG#2729、ラビットモノクローナル一次抗体にはRabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control#3900、マウスモノクローナルIgG1一次抗体にはMouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control#5415、マウスモノクローナルIgG2a一次抗体にはMouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656、マウスモノクローナルIgG2b一次抗体にはMouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484、Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988を使用してください。同一濃度のアイソタイプコントロールを用い、また、一次抗体のサンプルと並行してプロトコールを進める必要があります。
- 1 mg/mLの細胞ライセート200 μLに、Protein A (#9863) またはProtein G (#37478) アガロース50%ビーズスラリー 20 μL、ビオチン化抗体にはストレプトアビジン (Sepharose®ビーズ標識#3419) 10 μLを加えてください。
- ローテーターを用いて、4°Cで30-60分間インキュベートしてください。
- 4°Cで10分間遠心分離してください。上清を新しいチューブに移してください。
- 使用される一次抗体に応じて、適切な下記手順へ進んでください。
非標識一次抗体を使用する場合
- 製品データシートに記載されている推奨希釈率に従い、一次抗体を、細胞ライセート 200 µLに加えてください。静かに振盪しながら4°Cで一晩インキュベートしてください。
- Protein A (#9863) あるいはProtein G (#37478) アガロース (50% ビーズスラリー20 µL) を加えてください。静かに振盪しながら4°Cで1-3時間インキュベートしてください。
- 4°Cで30秒間遠心分離してください。ペレットを1X Cell Lysis Buffer 500 µLで5回洗ってください。洗いの操作は氷上で行ってください。
- ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼアッセイで解析してください (セクションD) 。
ビオチン標識一次抗体を使用する場合
- ビオチン標識抗体を製品データシートに推奨されている適切な希釈率になるように、細胞ライセート200 µLに加えてください。静かに振盪しながら4°Cで一晩インキュベートしてください。
- ビーズ標識ストレプトアビジン (Sepharose®ビーズ標識#3419) を静かに混ぜ合わせ、スラリー10 µLを加えてください。静かに振盪しながら4°Cで2時間インキュベートしてください。
- 4°Cで30秒間遠心分離してください。ペレットを1X Cell Lysis Buffer 500 µLで5回洗ってください。洗いの操作は氷上で行ってください。
- ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼアッセイで解析してください (セクションD) 。
ビーズ標識抗体 (Sepharose®ビーズ標識) を使用する場合
- 静かに攪拌したビーズ標識抗体 (10 μL) を1 mg/mLの細胞ライセート200 μLに加えてください。静かに振盪しながら4°Cで一晩インキュベートしてください。
- 4°Cで30秒間遠心分離してください。ペレットを1X Cell Lysis Buffer 500 µLで5回洗ってください。洗いの操作は氷上で行ってください。
- ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼアッセイで解析してください (セクションD) 。
ビーズ標識抗体 (磁気ビーズ標識) を使用する場合
- 静かに攪拌したビーズ標識抗体 (10 μL) を1 mg/mLの細胞ライセート200 μLに加えてください。静かに振盪しながら4°Cで一晩インキュベートしてください。
- チューブをMagnetic Separation Rack (#7017あるいは#14654) に設置することで、磁気ビーズを分離させ、溶液が澄むまで1-2分間静置してください。ペレットを1X Cell Lysis Buffer 500 µLで5回洗ってください。洗いの操作は氷上で行ってください。
- ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼアッセイで解析してください (セクションD) 。
D. サンプルの解析
以下のステップから適切な操作に進んでください。
注意:磁気ビーズは、遠心分離しないでください。その代わりにMagnetic Separation Rack (#7017 または #14654) を使用してください。
ウェスタンブロッティングで解析する場合
- ペレットを3X SDSサンプルバッファー20 - 40 µLで再懸濁してください。ボルテックスした後、30秒間遠心分離してください。
- サンプルを95 - 100°Cで2 - 5分間加熱し、14,000 x gで1分間遠心分離してください。
- サンプル (15 - 30 µL) をSDS-PAGEゲルにロードしてください。
- サンプルをウェスタンブロット解析してください (ウェスタンブロッティングプロトコールをご覧ください)。
注意:分子量が50 kDa付近のタンパク質の検出では、変性した重鎖によるマスキングを最小化するために、Mouse Anti-rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) あるいはMouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) を二次抗体として使用することをお勧めします。分子量が25 kDa付近のタンパク質には、Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) あるいはMouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) (#5127) をお勧めします。
キナーゼアッセイで解析する場合
- ペレットを1X Kinase Buffer 500 µLで2回洗ってください。氷上に保持してください。
- 200 µM ATPと適切な基質を添加した1X Kinase Buffer 40 µLでペレットを懸濁してください。
- 30°Cで30分間インキュベートしてください。
- 3X SDSサンプルバッファー20 µLで反応を停止させます。ボルテックスした後、30秒間遠心分離してください。
- リン酸化基質を含む上清を、新しいチューブに移して下さい。
- サンプルを95 - 100°Cで2 - 5分間加熱し、14,000 x gで1分間遠心分離してください。
- サンプル (15 - 30 µL) をSDS-PAGEゲルにロードしてください。
ご質問がありましたら、いつでもお問い合わせください。