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PathScan® Sandwich ELISA Antibody Pair プロトコール (ELISA-Pair)

A. 溶液および試薬

注意:溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS) (#9808):1X PBS 1 Lを調製する場合、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  2. 洗浄バッファー:1X PBS/0.05% Tween® 20 (20X PBST #9809)
  3. ブロッキングバッファー:1X PBS/0.05% Tween® 20​、1% BSA
  4. 1X Cell Lysis Buffer​:10X Cell Lysis Buffer (#9803):1X Cell Lysis Buffer 10 mLを調製するために、10X Cell Lysis Buffer 1 mLを精製水 (dH2O) 9 mLに加えて混ぜ合わせてください。PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer (#7018) 1X:このバッファーは、ready to useです。調製したバッファーは、4℃で短期間 (1-2週間) 保存できます。

    推奨​:1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) (#8553) を使用直前に加えてください。

    注意:溶解バッファーの推奨については、製品のデータシートまたはウェブページを参照してください。

  5. ウシ血清アルブミン (BSA):(#9998)
  6. TMB基質​:(#7004)
  7. STOP溶液​:(#7002)

    注意:試薬は毎日新たに調製し直さなければなりません。

B. 細胞ライセートの調製

接着細胞の場合

  1. 密度が​80​-90%コンフルエントの細胞を用意し、培地を吸引除去してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 細胞を氷冷した1X PBSで1回洗浄してください。
  3. PBSを除去し、各プレート (10 cm径) に氷冷した1X Cell Lysis Buffer + 1 mM PMSF混合液0.5 mLを加え、プレートを氷上で5分間インキュベートしてください。
  4. 細胞をプレートから掻き取り、適切なチューブに移してください。氷上に保持してください。
  5. ライセートを氷上で超音波処理 (ソニケーション) してください。
  6. 4°Cで10分間遠心分離 (x14,000 rpm) し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。1回分ずつに分注し、-80℃で保存してください。

浮遊細胞の場合

  1. 解析対象となる細胞を増殖させ、生細胞密度が0.5​-1.0 x 106細胞/mLに達したら、低速遠心分離 (~1,200 rpm) で細胞を集め、培地を除去してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 低速遠心分離 (~1,200 rpm) により細胞を回収し、5​-10 mLの氷冷した1X PBSで1回洗ってください。
  3. 増殖培地50 mLから回収した細胞を、1X Cell Lysis Buffer + 1 mM PMSF混合液2.0 mLで溶解してください。
  4. ライセートを氷上で超音波処理 (ソニケーション) してください。
  5. 4°Cで10分間遠心分離 (x14,000 rpm) し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。1回分ずつに分注し、-80℃で保存してください。

C. 固相化

  1. マイクロプレートを精製水 (dH2O) 200 μLですすぎ、残っている液を捨ててください。ウェルを乾燥させるため、ペーパータオルで水気を拭き取ってください。
  2. 捕捉抗体を1X PBSで100​倍に希釈してください。96ウェルプレート1枚につき、捕捉抗体ストック100 μLを1X PBS 9.9 mLに加えてください。十分に混合し、各ウェルに100 μLを加えてください。プレートを密封したのち、4°Cで一晩インキュベートしてください (17​-20時間)。
  3. 一晩固相化した後に、静かにプレートのカバーを外し、ウェルを洗ってください​:
    1. 廃棄容器にプレートの内容物を捨ててください。
    2. 毎回、1ウェルあたり200 μLの洗浄バッファーで4回洗ってください。各洗いの操作で、各ウェルに残った液を除去するために、十分な強さでプレートを新しいペーパータオルに叩きつけてください。ただし、常にウェルを乾燥させないようにしてください。
    3. 糸くずの出ないティッシュ (キムワイプ) で全てのウェルの裏側を拭いてください。
  4. プレートをブロッキングしてください。各ウェルに​ブロッキングバッファー150 μLを加え、プレートを密封したのち、37°Cで2時間インキュベートしてください。
  5. ブロッキングの後、プレートを洗ってください (セクションC、ステップ3)。これでプレートはすぐに使える状態です。

D. 操作手順

  1. 溶解物は、そのまま、もしくはブロッキングバッファーで希釈して使用します。各ウェルにライセート100 μLを加えてください。プレートを密封し、37°Cで2時間インキュベートしてください。
  2. プレートを洗ってください (セクションC、ステップ3)。
  3. 検出抗体をブロッキングバッファーで1:100に希釈してください。96ウェルのプレート1枚につき、検出抗体ストック100 μLをブロッキングバッファー9.9 mLに加えてください。十分に混合し、各ウェルに100 μLを加えてください。プレートを密封して37°Cで1時間インキュベートしてください。
  4. プレートを洗ってください (セクションC、ステップ3)。
  5. 抗マウスまたは抗ウサギのHRP標識二次抗体 (あるいはHRP標識ストレプトアビジン) をブロッキングバッファーで1:1000​に希釈してください。96ウェルのプレート1枚につき、二次抗体ストック10 μLをブロッキングバッファー9.99 mLに加えてください。十分に混合し、各ウェルに100 μLを加えてください。密封して37°Cで30分間インキュベートしてください。
  6. プレートを洗ってください (セクションC、ステップ3)。
  7. 各ウェルにTMB基質100 μLを加えてください。密封して37°Cで10分間インキュベートしてください。
  8. 各ウェルにSTOP溶液100 μLを加えてください。数秒間静かに振盪してください。
  9. マイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度を測定してください。
    1. ​目視による呈色の判定​:STOP溶液を加えてから30分以内に結果を判定してください。
    2. ​吸光度測定​:糸くずの出ないティッシュ (キムワイプ) で全てのウェルの裏側を拭いてください。STOP溶液を加えてから30分以内に450 nmの吸光度を測定してください。

更新:2008年1月

改訂日2013年9月

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