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ウェスタンブロッティングプロトコール (蛍光)

転写膜と一次抗体を静かに振盪しながら、4℃で一晩反応させてください。一次抗体の希釈液として、0.1% Tween® 20​含有1X TBSを用いて、5% (w/v) に溶解したBSAあるいは脱脂粉乳を使用します。

注意:二色同時検出のウェスタンブロッティングでは、異なる種の一次抗体と、異なる色素で標識した適切な二次抗体が必要です。エピトープのオーバーラップは干渉を生じることがあり、2重蛍光ウェスタンブロットではこれを考慮する必要があります。一次抗体のインキュベーションバッファーが異なる場合は、一次抗体を両方のバッファーで別々にテストし、同時検出に最も適したバッファーを特定してください。

A. 溶液および試薬

注意:溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS) (#9808):1X PBS 1 Lを調製する場合、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  2. 10X Tris Buffered Saline (TBS):(#12498) 1X TBS 1 L の調製:10X TBS 100 mlを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  3. 1X SDSサンプルバッファー:Blue Loading Pack (#7722) またはRed Loading Pack (#7723)。1/10容量の30X DTTを3X SDSローディングバッファーに加え、還元作用を持つ新しい3X ローディングバッファーを調製してください。精製水 (dH2O) で1X に希釈してください。
  4. 10X トリス-グリシンSDS泳動バッファー:(#4050) 1X 泳動バッファー1 Lの調製:10X 泳動バッファー100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  5. 10X トリス-グリシン転写バッファー:(#12539) 1X 転写バッファー 1 Lの調製:10X 転写バッファー100 mLをメタノール200 mLと精製水 (dH2O) 700 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  6. Tween® 20含有10X トリス緩衝生理食塩水 (TBST-10X):(#9997) 1X TBST 1 Lの調製:10X TBST 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  7. 脱脂粉乳 (#9999)
  8. ブロッキングバッファー:5% w/v 脱脂粉乳含有1X TBS;150 mL用意する場合は、脱脂粉乳7.5 gを1X TBS 150 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。自家蛍光や非特異的バックグラウンドの増加の原因となるので、Tween® 20はブロッキングバッファーに加えないようにしてください。ブロッキングステップの後、抗体の希釈バッファーにTween® 20を再度添加することができます。
  9. 洗浄バッファー:1X TBST
  10. ウシ血清アルブミン (BSA):(#9998)
  11. 一次抗体希釈バッファー:5% w/v BSAあるいは5%脱脂粉乳含有1X TBST (どちらを推奨するかは各製品のデータシートで確認してください):20 mLを用意する場合は、BSAか脱脂粉乳1.0 gを1X TBST 20 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  12. 二次抗体希釈バッファー:5% w/v 脱脂粉乳含有1X TBST:20 mL用意する場合は、脱脂粉乳1.0 gを1X TBST 20 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。(二次抗体:anti-rabbit #5151および#5366:anti-mouse #5257および#5470)。
  13. ​Prestained Protein Marker、Broad Range (11-190 kDa):(#13953)
  14. 転写膜​とろ紙:(#12369) このプロトコールはニトロセルロース膜用に最適化されています (推奨)。ポアサイズは0.2 µmをお勧めしています。

B. タンパク質のブロッティング

最も汎用的なサンプル調製プロトコール

  1. 目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 培養液から培地を吸引除去し、冷やした1X PBSで細胞を洗ったのち、再度吸引除去してください。
  3. 1X SDSサンプルバッファーを加え (6ウェルプレートは100 µL/ウェル、直径10 cmのプレートは500 µL/プレート)、細胞を溶解してください。直ちにプレートから細胞を掻き取り、抽出物を遠心分離チューブに移してください。氷上に保持してください。
  4. 10-15秒間超音波処理してください。この処理には、細胞を完全に溶解する目的と、DNAを剪断してサンプルの粘性を下げる目的があります。
  5. サンプル20 µLを95-100℃で5分間加熱処理後、氷上で冷却してください。
  6. 5分間遠心分離してください。
  7. SDS-PAGEゲル (10 cm × 10 cm) に20 µLをアプライし、電気泳動してください。

    注意:電気泳動確認と分子量決定のために、プレステイン分子量マーカー (#13953、10 µL/lane) もアプライして電気泳動することをお勧めします。着色マーカーは近赤外波長の自家蛍光があります。

  8. ニトロセルロース膜 (#12369) に転写してください。

C. 転写膜のブロッキングと抗体反応

注意:10 cm × 10 cm (100 cm2) の転写膜用の必要量を記載しています。サイズの異なる転写膜をご使用の際は、適宜量を調節してください。

  1. オプション:転写後、転写膜を室温で5分間、TBS 25 mLで洗ってください。
  2. 転写膜を室温で1時間、ブロッキングバッファー25 mL中でインキュベートしてください。

    重要なステップ:ブロッキングバッファーにはTween® 20を入れないでください (セクションA、ステップ8)。

  3. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  4. 一次抗体反応液10 mL (製品データシートに記載されている希釈バッファー、希釈率をもとに適切に調製してください) 中で転写膜を静かに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
  5. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  6. 蛍光標識二次抗体 (#5470#5257#5366#5151) (ストック:1 mg/mL) を二次抗体希釈バッファーで1:5000-1:25,000に希釈し、二次抗体液10mL中で転写膜を静かに振盪しながら、室温で1時間インキュベートしてください。
  7. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。

D. タンパク質の検出

  1. 余分なTBSTを除去し、転写膜を乾かしてください。

    重要なステップ:蛍光染色のために転写膜は乾燥させる必要があります。

  2. 適切な蛍光スキャナーを使用して、メーカーの指示に従い転写膜をスキャンしてください。

更新:2008年5月

改訂日:2016年6月

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