ウェスタンブロッティングプロトコール (脱脂粉乳で一次抗体反応を行う場合)

ウェスタンブロットでは、抗体を希釈液 (5% w/v 脱脂粉乳、1X TBS、0.1% Tween- 20) で希釈した一次抗体反応液中で、転写膜を緩やかに振盪しながら4℃で一晩インキュベートしてください。

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A. 溶液および試薬

注意：Milli-Qまたは同等の精製水で溶液を調製してください。

1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS)
2. 1X SDS Sample Buffer： (#7722​、#7723) 62.5 mM Tris-HCl (25°CでpH 6.8)、2% w/v SDS、10%グリセロール、50 mM DTT、0.01% w/v bromophenol blueまたはphenol red
3. 転写バッファー： 25 mM Tris base、0.2 Mグリシン、20%メタノール (pH 8.5)
4. 10X Tris Buffered Saline (TBS) (#9997) 10X TBSを1 L調製する場合は、Tris base ​24.2 g、NaCl 80 gを精製水に溶解し、HClでpHを7.6に調節してください (1X で使用)
5. 脱脂粉乳 (#9999)
6. ブロッキングバッファー：5%脱脂粉乳を添加した、0.1% w/v Tween-20含有1X TBS：150 mLを調製する場合、10X TBS 15 mLを水135 mLに加えて撹拌してください。脱脂粉乳7.5 gを加えてよく混ぜ合わせ、完全に溶解してください。撹拌しながらTween-20 (100%) を0.15 mL加えてください。
7. 洗浄バッファー： 0.1% Tween-20含有1X TBS (TBS/T)
8. 一次抗体希釈バッファー： 5%脱脂粉乳、0.1% Tween-20を添加した1X TBS。20 mLを調製する場合は、10X TBS 2​ mLを精製水 18 mLに加えて混ぜ合わせてください。脱脂粉乳1.0 gを加えてよく混ぜ合わせ、完全に溶解してください。撹拌しながらTween-20 (100%) を20 μL加えてください。
9. Phototope^®-HRP Western Blot Detection System (#7071 anti-rabbit) または (#7072 anti-mouse) 本製品は、Biotinylated Protein Ladder、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) へ標識した二次抗体 (#7074 anti-rabbit) または (#7076 anti-mouse)、anti-biotin antibody conjugated to HRP、chemiluminescent reagent、peroxideを含みます。
10. Prestained Protein Marker, Broad Range (Premixed Format) (#7720)
11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack： (#7727)
12. 転写膜：このプロトコールはニトロセルロース膜を用いて最適化されています (CST推奨)。PVDF転写膜も使用できます。

B. タンパク質のブロッティング

一般的なサンプル調製は、下記プロトコールを参照してください。

1. 目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
2. 培養ディッシュから培地を吸引除去し、細胞を1X PBSで洗った後、再度吸引除去してください。
3. 1X SDSサンプルバッファーを加え (6ウェルプレートは100 µL/ウェル、直径10 cmのプレートは500 µL/プレート)、細胞を溶解してください。直ちにプレートから細胞を掻き取り、抽出物を遠心分離チューブに移してください。氷上に保持してください。
4. 10-15秒間超音波処理してください。この処理には、細胞を完全に溶解する目的と、DNAを剪断してサンプルの粘性を下げる目的があります。
5. サンプル20 µLを95-100℃で5分間加熱処理後、氷上で冷却してください。
6. 5分間遠心分離してください。
7. SDS-PAGEゲル (10 cm x 10 cm) に20 µLアプライし、電気泳動してください。

注意：CSTは、電気泳動および転写の確認のためプレステイン分子量マーカー (#7720, 10 μL/レーン) を、分子量のの決定のためにビオチン化プロテインラダー (#7727, 10 μL/レーン) を、それぞれ同時に電気泳動することをお勧めしています。

1. ニトロセルロース膜またはPVDF膜に転写してください。

C. 転写膜のブロッキングと抗体反応

注意：10 cm × 10 cm (100 cm²) の転写膜用の必要量を記載しています。サイズの異なる転写膜をご使用の際は、適宜量を調節してください。

1. オプション：転写後、ニトロセルロース膜を室温で5分間、TBS 25 mLで洗ってください。
2. 転写膜を室温で1時間、ブロッキングバッファー25 mL中でインキュベートしてください。
3. TBS/T 15 mLで5分間、3回洗ってください。
4. 一次抗体10 mL (製品のデータシートに記載されている希釈バッファー、希釈率をもとに適切に調製してください) 中で転写膜を静かに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
5. TBS/T 15 mLで5分間、3回洗ってください。
6. 適切なHRP標識二次抗体 (2000​倍希釈、一次抗体の検出) およびHRP標識ビオチン抗体 (1000​倍希釈、ビオチン標識プロテインラダーの検出) を含むブロッキングバッファー10​ mL中で、転写膜を穏やかに振盪しながら室温で1時間インキュベートしてください。
7. TBS/T 15 mLで5分間、3回洗ってください。

D. タンパク質の検出

1. 転写膜をLumiGLO (0.5 mL 20X LumiGLO、0.5 ml 20X Peroxide、9.0 mL Milli-Q水) 10 mL中で、穏やかに振盪しながら室温で1分間インキュベートしてください。

注意：反応が速すぎる場合は、LumiGLO基質をさらに希釈して使用してください。

1. 転写膜の余分な液を除去し (この時、乾燥させないようにご注意ください)、ラップで包んでX線フィルムに露光してください。初めに10秒間の露光をして、適度な露光時間を予測することができます。

注意：検出反応の速度論に従い、シグナルはLumiGLOインキュベーション開始直後が最も強く、2時間かけて減退します。