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ウェスタンブロッティングトラブルシューティングガイド

推奨: お客様の実験での潜在的な問題を特定するために、不適切なウェスタンブロット結果の原因となり得る、下記のよくある事象リストからお選びください。

問題:バックグラウンドが高い、あるいはエクストラバンドがある

全体的にバックグラウンドが高い、または短時間のフィルム露光でも非特異バンドがみられる。ただし、モチーフ抗体を使用する場合や、翻訳後修飾 (PTM) やスプライスバリアントがある場合は、多重バンドが生じる可能性があるということをご承知おきください。

高いバックグラウンドシグナルの問題克服方法はこちらのクリップをご覧ください

ライセートの調製

新しく調製したサンプルでは非特異的バンドや分解したバンドが減少し、よりクリーンなブロットが得られます。一般に、組織の抽出物では、結合組織により、細胞株のライセートよりも多くのバックグラウンドバンドや分解産物が含まれる傾向があります。超音波処理して不純物を除去した新鮮な組織ライセートを使用することで、バックグラウンドを低減できる可能性があります。リン酸化ターゲットを検出するためには、サンプルは常に、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤 (Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) #5870Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) #5872Protease Inhibitor Cocktail #5871) を含む適切なバッファーで溶解する必要があります。サンプル調製とタンパク質の濃度測定に、Cell Lysis Buffer (#9803) あるいはより強力な界面活性剤を含むRIPA Buffer (#9806) を使用することをお勧めします。SDS loading buffer (#7722あるいは#7723) は、タンパク質定量をしない場合のホールセルの溶解に使用することができます。Chaps Cell Extract Buffer (#9852​) は細胞質画分の調製に使用され、カスパーゼシグナル伝達の研究に有用です。Cell Fractionation Kit (#9038) は、細胞質、膜/オルガネラ、および核/細胞骨格画分の調製に使用されます。

転写膜

高品質ニトロセルロース膜 (Nitrocellulose Sandwiches #12369) を使用してください。通常ポアサイズは0.2 µmをお勧めします。ポアサイズが0.45 µmの転写膜は30 kDa未満のタンパク質の検出にはお勧めできません。PVDF膜ではニトロセルロースよりも高いバックグラウンドが生じる可能性があります。ウェスタンブロッティングにナイロン膜の使用はお勧めしません。TBSTで希釈した5%脱脂粉乳で、室温で1時間ブロッキングしてください。

一次抗体の希釈とインキュベーション

推奨のブロッキング剤 (5% BSAあるいは5%脱脂粉乳) を添加したTBSTを用いて、一次抗体を推奨通りに希釈し、4°Cで一晩インキュベートしてください。個々の抗体の推奨希釈バッファーについては製品データシートを確認してください。

不適切な洗い

洗いはTBSTで5分間、3回行うことを推奨していますが、3回以下になることがよくあります。しかしながら、これは高いバックグラウンドにつながる可能性があります。正確性を保つために、洗いは時間を測って行うことをお勧めします。さらに、低濃度のTween® 20は高いバックグラウンドにつながる可能性があるため、0.1% Tween® 20​の使用をお勧めします。これは、一次抗体反応後と二次抗体反応後に行われる両方の洗いのステップについて言えることです。

二次抗体の希釈とインキュベーション

一部の二次抗体は、細胞ライセート中でタンパク質と非特異的に結合します。二次抗体の品質を評価するには、一次抗体なしでブロット (フィルム露光まで) を行ってください。二次抗体の濃度を最適化するために、同じ細胞ライセートと一次抗体を用いたブロットで、段階希釈した二次抗体を使用して検証することも可能です。二次抗体は常にTBSTで希釈した5%脱脂粉乳を用いて、室温で1時間インキュベートしてください。その際、二次抗体をBSAで希釈すると、より強いバックグラウンドバンドが生じます。CST™の二次抗体は既に最適化されているため、タイトレーションの必要はありません。

検出試薬

化学発光の検出には、濃縮試薬を希釈するために超純水が必要です。有機および無機不純物が除去された、純水のみを使用してください。RODI水の使用をお勧めします。さらに、検出ステップ前の抗体のインキュベーション中に、転写膜は絶対に乾かないようにしてください。

露光時間

フィルム露光時間が30秒を超えると、バックグラウンドシグナルが増加します。長い露光時間を避けるためには、適切なタンパク質発現レベルの細胞株または組織を使用し、推奨される一次抗体のインキュベーション条件 (一次抗体希釈、インキュベーションセクションを参照) を使用することが重要です。必要に応じて、発現や翻訳後修飾を誘導する処理を実施してください。

問題:シグナルが低い

ブロットのフィルムへの露光が短いと、標的タンパク質を検出することができません。

低いシグナルの問題の克服方法はこちらのクリップをご覧ください。

ライセートの調製

通常検出には、1レーンあたり、ホールセルの細胞ライセートからの総プロテインが20-30 µgあれば十分です。標的タンパク質の発現レベル、あるいはタンパク質の修飾レベルが低い場合は、化学刺激薬をよって発現または修飾を誘導する必要がある場合があります。標的タンパク質がより多く存在する、代替細胞株または組織を調べた方が良いかもしれません。サンプルは、リン酸化ターゲットのために、プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤 (Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) #5870、Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) #5872、Protease Cocktail #5871) を含む適切なバッファーで常に溶解する必要があります。クロマチンおよび膜結合型の標的タンパク質を効率的に抽出するためには、ライセートを常に超音波処理する必要があります。推奨されるポジティブコントロールと処理条件については、弊社ウェブサイトの「コントロール表」をご覧ください。

一次抗体の希釈とインキュベーション

推奨のブロッキング剤 (5% BSAあるいは5%脱脂粉乳) を添加したTBSTを用いて、一次抗体を推奨通りに希釈し、4°Cで一晩インキュベートしてください。ゼラチン、血清、タンパク質不含ブロッキング剤、カゼイン、あるいは混合ブロッキング剤のような代替ブロッキング剤を使用すると、標的シグナルの強度が低減することがあります。個々の抗体を使って最適な結果を得るために、製品データーシートで推奨される希釈バッファーを確認してください。

SDS-PAGEゲルの選択

一般的には、Tris-Glycineゲルが推奨されます。ただし、高分子量のタンパク質では、Tris-Acetateゲルとその関連バッファーの使用をお勧めします。タンパク質は、1.5 mmゲルよりは1 mmゲルからの方がより効率的に転写されます。厚いゲルを使用すると高分子タンパク質の不完全な転写の原因となるため、関心のある標的タンパク質の大きさに合わせて転写条件を変更することをお勧めします。

転写と転写膜

不完全な転写は、長い転写時間や高い電圧にすることで改善される可能性があります。一般的には、20%のメタノール含むトランスファーバッファーを使用し、ウェット式転写を70Vで2時間行うことをお勧めします。より高い分子量のタンパク質では、転写効率を改善し、ゲルマトリックス内に大型タンパク質が残留するのを防ぐため、トランスファーバッファーのメタノールを5%に減らし、同時に転写時間を70 Vで3時間に延長することをお勧めします。ただし、低分子量のタンパク質の解析では、転写膜を通過するような過剰な転写は問題になることがあります。低分子量タンパク質の場合は、0.2 µmのポアサイズの転写膜の使用と、70 Vで1.5時間実施するウェット式の転写が重要です。0.45 µmのポアサイズの転写膜や一晩かけた転写は、過剰な転写の原因となり、低分子量タンパク質のシグナルが得られない原因となります。

ブロッキング

抗原エピトープが不明瞭になり、抗体の結合が阻害されるおそれがあるため、長時間のブロッキングは避けなければなりません。室温で1時間だけブロッキングしてください。

洗い

推奨の5分間3回よりも長く洗ってしまうことがよくありますが、これはシグナル低下につながる可能性があります。正確性を保つために、洗いは時間を測って行うことをお勧めします。TBSTは0.1% Tween® 20を含む必要があります。これは、一次抗体反応後と二次抗体反応後に行われる両方の洗いのステップについて言えることです。さらに、PBSTを用いた洗いはシグナル低下につながることが示されているため、TBSTで洗うことをお勧めします。

二次抗体の希釈とインキュベーション

二次抗体の濃度を最適化するために、同じ細胞ライセートと一次抗体を用いたブロットで、段階希釈した二次抗体を使用して検証することも可能です。二次抗体は常にTBSTで希釈した5%脱脂粉乳を用いて、室温で1時間インキュベートしてください。アジ化物はHRP活性を阻害するため、HRP標識二次抗体のバッファーにはアジ化物ナトリウムを入れないでください。CST™の二次抗体は既に最適化されているため、タイトレーションの必要はありません。

検出試薬

化学発光検出のポジティブコントロールとして、抗ビオチン-HRPで検出可能なビオチン標識分子量スタンダードを使用してください。

更新 2005年6月

改訂日2013年11月

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