Aktシグナル伝達

Aktは、リン脂質との結合によって活性化されC末端に位置するSer473がリン酸化されます。

Y294002 #9901 (PI3キナーゼ特異的阻害剤で、Aktのリン酸化を阻害する) で処理したヒト前立腺がん細胞株、LNCaP細胞ペレットのパラフィン包埋切片と、未処理コントロール切片をIHCで染色しました (図A)。ヒト乳がん組織も同様に、IHCで染色しました (図B)。

まず最初に、​細胞ペレットを用いてPhospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060​と他社製品のphospho-Akt antibodyの最適希釈率を決定しました (​図A)。

その後、至適希釈率でこれらの抗体を用い、ヒト乳がん組織の染色で、2つの抗体を比較しました (図B)。#4060​で染色した場合、他社製品を用いた場合と比較して、有意に強く、特異的な染色像が得られました。

細胞ペレットを染色した場合は、CST製品、他社製品とも良好な染色像が得られましたが、組織染色ではより高いレベルの感度が求められ、#4060​を用いた染色で、より明瞭な染色像が得られました。

図A

機能：Aktは、リン脂質との結合によって活性化されC末端に位置するSer473がリン酸化されます。

サンプル：C2C12マウス筋前駆細胞を、LY294002 #9901 (PI3キナーゼ特異的阻害剤で、Aktのリン酸化を阻害する) もしくは、インスリン (Aktのリン酸化を誘導する) で処理しました。

結果：実験で使用した抗体濃度は以下の通りです。

• CST #4060​：0.375 μg/mL
• 他社製品1： 0.5または2 μg/mL

• CSTの#4060 (緑) は、インスリン刺激後のひだ状膜/前縁への蓄積を適切に染色しましたが、LY294002処理した細胞ではほとんど染色がみられませんでした。
• 他社製品1を2 μg/mLで使用した場合、LY294002処理された細胞で、ぼやけた核のバックグラウンドとともに非常に強く細胞質を染色し、そのシグナル強度はインスリン処理した細胞の#4060と同程度でした。0.5 μg/mLで使用した場合、インスリン処理細胞でみられるシグナル強度は、#4060に比べ、低いものでした。

このことから、#4060​は、より低濃度で用いても、強いシグナル得られることが分かります。

図B

結果： 実験で使用した抗体濃度は以下の通りです。

• CST #4060​：0.375 μg/mL
• 他社製品2：0.625-1.25 μg/mL

• CST #4060 (緑) は、インスリン刺激後のひだ状膜や前縁に集積するシグナルを適切に染色しましたが、LY294002処理細胞ではほとんど染色がみられませんでした。
• 他社製品2​を1.25 μg/mLで使用した場合、LY294002処理した細胞とインスリン処理細胞の両方で、核に顕著なシグナルが観察され、バックグラウンドが強く出ることが分かります。0.625 μg/mLの抗体濃度では、インスリン処理細胞のシグナルはわずかに検出できる程度のものでした。

このことから、#4060​は、より低濃度で用いても、強いシグナル得られることが分かります。

機能：Aktは、リン脂質の結合とカルボキシ末端に位置するSer473のリン酸化によって活性化されます。

サンプル：Jurkat細胞を、Calyculin A #9902​ (強力なホスファターゼ阻害剤で、既存のAktリン酸化を保持する)、または、LY294002 #9901 (PI3キナーゼ特異的阻害剤で、Aktのリン酸化を阻害する) で処理しました。

• CSTのPhospho-Akt (Ser473) (D9E) XP^® Rabbit mAb #4060では、Calyculin Aで処理したJurkatライセートにおいて、60 kDaに強い特異的なバンドがみられました。
• 他社製品1 (リン酸化Akt (Ser473) ラビットポリクローナル抗体) では、適切なバンドのほか、~75 kDaに交差反応したバンドがみられました。この抗体は、必ずしもリン酸化Aktに特異的ではないと考えられます。
• (他社製品2 (リン酸化Akt (Ser473) ラビットポリクローナル抗体) では、適切なバンドより強い、複数の非特異的なバンドがみられました。