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フローサイトメトリー (F) プロトコール (転写因子の検出)

A. 溶液および試薬

注意:溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phospate Buffered Saline (PBS): (#9808):1X PBS 1 Lを調製する場合、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  2. ホルムアルデヒド (メタノール不含)
  3. 2%ホルムアルデヒド (PBS希釈液を実験日当日に用事調製してください)
  4. Triton™ X-100
  5. インキュベーションバッファー:Bovine Serum Albumin (BSA) (#9998) 0.5 gを1X PBS 100 mLに溶解してください。4℃で保存してください。

B. 固定

注意:表面抗原の免疫染色は、固定/浸透化の前の生細胞を使って、メーカーの推奨に従って行なってください。

  1. 新たに単離した細胞懸濁液の濃度を調整して、チューブ1本あたり、1-2​ x 106​細胞を100 μLのインキュベーションバッファーに懸濁した液を調製してください。
  2. メーカーの推奨する量または濃度に従い、表面抗原に対する抗体をアッセイチューブに加え、氷上で30分間インキュベートしてください。
  3. インキュベーションバッファー2 mLを加えて細胞を洗浄し、遠心分離で細胞を集めてください。
  4. 上清を吸引除去し、2%ホルムアルデヒド500 μLで再懸濁してください。
  5. 室温で15分間固定してください。
  6. インキュベーションバッファーを加えて遠心分離し、2回洗ってください。

C. 透過化処理

  1. 0.1% Triton™ X-100 (v/v in PBS) 1 mLを細胞ペレットに加えてください。
  2. 再懸濁し、室温で30分間置いてください。
  3. インキュベーションバッファーを加えて遠心分離し、2回洗ってください。

D. 免疫染色

  1. 細胞ペレットを​100 μLの一次抗体反応液に再懸濁してください。一次抗体反応液は、個々の抗体のデータシートもしくはウェブページに記載されている推奨希釈率に従い、インキュベーションバッファーで希釈してください。
  2. 室温で1時間インキュベートしてください。
  3. インキュベーションバッファーを加えて遠心分離し、2回洗ってください。
  4. 蛍光標識一次抗体を用いた場合は、細胞をインキュベーションバッファー350 μLに再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。未標識一次抗体やビオチン化一次抗体を用いる場合はステップ 5に進んでください。
  5. インキュベーションバッファーを用いて推奨希釈率に希釈した蛍光標識二次抗体で細胞を再懸濁してください。
  6. 室温で30分間インキュベートしてください。
  7. インキュベーションバッファーを加えて遠心分離し、2回洗ってください。
  8. 細胞をインキュベーションバッファー350 μLに再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。

更新:2013年12月

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