次の製品の専用プロトコールです: PathScan® Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit (Chemiluminescent Readout) #12856
以下に従い、1X Detection Antibody Cocktailを調製してください:
スライド1枚のみで実施する場合:10X Detection Antibody Cocktail 150μLをArray Diluent Buffer 1350 μLで希釈してください。
スライド2枚で実施する場合:10X Detection Antibody Cocktail 300μLをArray Diluent Buffer 2700 μLで希釈してください。氷上に保持してください。
金属クリップをガスケットの溝に挿入して、クリップをロック位置まで回転させてください。クリップが、スライドの目印の線と、同じ側に乗っていることを確認してください。
注意:1つのクリップには上部の溝に小さな点が刻まれていて、パッドの印に合わせて組み上げることができます (スライドの組み上げ写真をご確認ください)。
Array Blocking Buffer 100 µLを各ウェルに加え、シーリングテープで覆って、オービタルシェーカー上で15分間、室温でインキュベートしてください。
注意:アッセイ中はパッドが乾燥しないようにしてください。
使用する直前に、LumiGLO試薬およびPeroxide試薬を希釈・混合し、化学発光試薬を調製してください。1Xの溶液10 mLを作成する場合、脱イオン水9 mL、20X LumiGLO 0.5 mL、20X Peroxide 0.5 mLを混合してください。
Kodak Biomaxフィルムをご利用の方へ:LumiGLO/Peroxideをこの希釈率で用いた場合、一部の標的については非常に短い露光時間 (2-3 秒) で露光過多となる場合があります。露光時間をより操作しやすい時間 (20 ‑ 30秒) にするには、脱イオン水20 mLをLumiGLO/Peroxide混合液10 mLに加え、3倍希釈した化学発光試薬を調製してください。
速やかに、化学発光シグナルの検出が可能なデジタルイメージングシステムを使用して、スライドの画像を撮影してください。必要に応じて、市販のアレイイメージ解析ソフトウェアを使用して、スポットの強度を定量してください。別法として、化学発光フィルムも使用することもできます。現像カセットの上から均一な力で軽く押し、フィルムを2 - 30秒間露光してください (カセットのクランプは締めず、LumiGLO/Peroxide試薬を絞り出さないように注意してください)。自動フィルム現像装置を使用して、フィルムを現像してください。
注意:スライドを両方使用する場合、同じ現像カセット内でこれらを同時に露光することは推奨しません。この場合、最初のスライドを使用して、ステップ13–18で処理している間、2番目のスライドはWash Buffer中に入れて静置してください (ステップ12) 。最初のスライドが終了した後、2番目のスライドと新たに希釈されたLumiGLO®/Peroxide試薬を使用して、ステップ13 - 18へと進んでください。
更新:2013年11月