PathScan® Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit (Chemiluminescent Readout) プロトコール # 12856

次の製品の専用プロトコールです： PathScan^® Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit (Chemiluminescent Readout) #12856

A. 細胞ライセートの調製

1. 1X Cell Lysis Buffer (#7018) を解凍し、十分に混ぜ合わせてください。Protease Inhibitor Cocktail (100X) (#5871)を1X Cell Lysis Bufferに添加してください。Lysis Bufferは氷上に保持してください。
2. 培地を取り除き、細胞を氷冷した1X PBSで1回洗ってください。
3. PBSを取り除き、氷冷した1X Cell Lysis Bufferを加えてください。接着細胞には、各プレート (10 cm径) に1X Cell Lysis Buffer #7018 0.5 mLを使用してください。氷上で2分間インキュベートしてください。
4. ライセートを遠心分離用チューブへ移して、最大速度、4℃で2分間遠心分離してください。
5. 上清を新しいチューブに移してください。この上清が細胞ライセートです。ライセートはすぐに使用するか、1回分ずつに分注して-80℃で保存することができます。
6. アッセイを行なう直前に、ライセートをArray Diluent Bufferで0.2 – 1.0 mg/mLに希釈してください。使用するまで、氷上に保持してください。

B. アッセイ手順

1. 使用前に、ガラススライドとBlocking Bufferを室温に戻してください。
2. 20X Array Wash Bufferを脱イオン水で希釈して、1X Array Wash Bufferを調製してください (20X Array Wash Buffer 1 mLを脱イオン水 19 mLで希釈してください)。1X Array Wash Bufferとしてラベルしてください。希釈後は室温に保持してください。

3. 以下に従い、1X Detection Antibody Cocktailを調製してください：

   スライド1枚のみで実施する場合：10X Detection Antibody Cocktail 150μLをArray Diluent Buffer 1350 μLで希釈してください。

   スライド2枚で実施する場合：10X Detection Antibody Cocktail 300μLをArray Diluent Buffer 2700 μLで希釈してください。氷上に保持してください。

4. 10X HRP-linked StreptavidinをArray Diluent Bufferで希釈し、1X HRP-linked Streptavidinを調製してください。氷上に保持してください。
5. マルチウェルガスケットをガラススライドに取り付けてください (下の図をご参照ください)：
   1. 実験台上に、マルチウェルガスケットを下向きにに置いてください (シリコンレイヤー側が上向きになります)。プラスティック保護フィルムを除去してください。
   2. ガラススライドを、ニトロセルロースパッド面を下に向け、ガスケットの開放部にパッドを合わせながら、マルチウェルガスケットの上に注意深く置いてください。スライドを垂直に向けた際に、目印の線が左上の隅に現れます。

   3. 金属クリップをガスケットの溝に挿入して、クリップをロック位置まで回転させてください。クリップが、スライドの目印の線と、同じ側に乗っていることを確認してください。

      注意：1つのクリップには上部の溝に小さな点が刻まれていて、パッドの印に合わせて組み上げることができます (スライドの組み上げ写真をご確認ください)。

   4. クリップを所定の位置までスライドさせてください。
   5. 同様に、マークされていないクリップを組み上げたもう一方の側にカチッとはめ込み、所定の位置までスライドさせます。
   6. アレイの組み立て準備が整いました。

6. Array Blocking Buffer 100 µLを各ウェルに加え、シーリングテープで覆って、オービタルシェーカー上で15分間、室温でインキュベートしてください。

   注意：アッセイ中はパッドが乾燥しないようにしてください。

7. Array Blocking Bufferを、液体を軽くはじき落とすようにしてシンクやその他適切な廃棄場所へ廃棄してください。希釈したライセート50–75 µLを各ウェルに加え、シーリングテープで覆って、オービタルシェーカー上で2時間、室温で (または一晩、4℃で) インキュベートしてください。
8. ウェル内の液体を軽くはじき落とすようにして、シンクやその他適切な廃棄場所へ廃棄してください。1X Array Wash Buffer 100 µLを各ウェルに加え、オービタルシェーカー上で5分間、室温でインキュベートしてください。この操作を3回繰り返してください。ウェル内の液体を廃棄してください。
9. 1X Detection Antibody Cocktail 75 µLを各ウェルに加え、シーリングテープで覆って、オービタルシェーカー上で1時間、室温でインキュベートしてください。
10. ステップ8と同様にして、1X Array Wash Buffer 100 µLで4​-5分間洗ってください。
11. 1X HRP-Linked Streptavidin 75 µLを各ウェルに加え、シーリングテープで覆って、オービタルシェーカー上で30分間、室温でインキュベートしてください。
12. ステップ8と同様にして、1X Array Wash Buffer 100 µLで4​-5分間洗ってください。
13. 金属クリップの底部をスライドの中央から引っ張ることで、マルチウェルガスケットを取り外し、その後スライドとガスケットを別々に剥がしてください。
14. スライドを上向きにプラスティックディッシュ (清潔なピペットチップ箱の蓋など) 内に移し、1X Array Wash Buffer 10 mLで軽く洗ってください。

15. 使用する直前に、LumiGLO^®​試薬およびPeroxide試薬を希釈・混合し、化学発光試薬を調製してください。1X 溶液10 mLを作成する場合、脱イオン水9 mL、20X LumiGLO^® 0.5 mL、20X Peroxide 0.5 mLを混合してください。

    Kodak^® Biomax^®フィルムをご利用の方へのご注意：LumiGLO^®/Peroxideをこの希釈率で用いた場合、一部の標的については非常に短い露光時間 (2-3 秒) で露光過多に達することがあります。露光時間をより操作しやすい時間 (20‑30秒) にするには、脱イオン水20 mLをLumiGLO^®/Peroxide混合液10 mLに加え、3倍希釈した化学発光試薬を調製してください。

16. Array Wash Bufferを除去して、スライドをLumiGLO^®/Peroxide化学発光試薬に浸してください。
17. LumiGLO^®/Peroxide化学発光試薬に浸っていることを確認しながら、スライドをシートプロテクターに移してください (スライドの上に、化学発光試薬を少量加えてください)。

18. 速やかに、化学発光シグナルの検出が可能なデジタルイメージングシステムを使用して、スライドの画像を撮影してください。必要に応じて、市販のアレイイメージ解析ソフトウェアを使用して、スポットの強度を定量してください。別法として、化学発光フィルムも使用することもできます。現像カセットの上から均一な力で軽く押し、フィルムを2​-30秒間露光してください (カセットのクランプは締めず、LumiGLO^® / Peroxide試薬を絞り出さないように注意してください)。自動フィルム現像装置を使用して、フィルムを現像してください。

    注意：スライドを両方使用する場合、同じ現像カセット内でこれらを同時に露光することは推奨しません。この場合、最初のスライドを使用して、ステップ13–18で処理している間、2番目のスライドはWash Buffer中に入れて静置してください (ステップ12) 。最初のスライドが終了した後、2番目のスライドと新たに希釈されたLumiGLO^®/Peroxide試薬を使用して、ステップ13​-18へと進んでください。

LumiGLO^®はKirkegaard & Perry Laboratoriesの登録商標です。

Kodak^®およびBioMax^®はEastman Kodak Companyの商標です。