各製品専用-免疫蛍光染色プロトコール：2187

次の製品の専用プロトコールです： Phospho-CENP-A (Ser7) Antibody #2187

A. 溶液および試薬

注意：Milli-Qまたは同等の精製水で溶液を調製してください。

• 10X Phosphate Buffered Saline (PBS)： 1 Lを準備する場合は、塩化ナトリウム (NaCl) 80 g、塩化カリウム (KCl) 2 g、リン酸水素ナトリウム (Na₂HPO₄) 14.4 g、リン酸カリウム (KH₂PO₄) 2.4 gを精製水 (dH₂O) 1 Lに溶解してください。pHを8.0に調整してください。
• ホルムアルデヒド (16%、メタノール不含、Polysciences, Inc. (cat# 18814))：新しい物を使用し、開封した瓶は暗所4°Cで保存し、使用の際はPBSで希釈してください。
• インキュベーションバッファー (1X PBS / 5% normal goat serum (#5425) / 0.3% Triton X-100)：
  25 mLを調製する場合は、10X PBS 2.5 mLを精製水 (dH₂O) 22.5 mLに加えて、混ぜ合わせてください。1.25 gのBSAを加えてよく混ぜ合わせてください。スターラーで撹拌しながら、Triton X-100 75 μL (100%) を加えてください。
• 蛍光色素標識二次抗体（推奨される二次抗体）
  注意：初めて一次抗体あるいは蛍光標識二次抗体をご使用になる際は、至適希釈率を決めるために抗体のタイトレーションを行ってください。
• Prolong Gold AntiFade Reagent (#9071) またはProlong Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)

B. 試料作製 - 培養細胞株 (IF-IC)

注意：マルチウェルプレート、チェンバースライドあるいはカバーガラス上で直接細胞を培養、薬剤処理、固定および染色してください。

1. 培地を吸引除去し、4%ホルムアルデヒド (PBSで希釈) を細胞が2～3 mm浸る程度に加えてください。
   注意：ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフト内でのみ使用してください。
2. 細胞を室温で15分間固定してください。
3. 固定液を吸引除去し、PBSで各5分間、3回洗ってください。
4. 免疫染色 (セクションC) に進んでください。

C. 免疫染色

注意：特に記載がない限り、下記全てのインキュベーションは室温で行い、乾燥と蛍光色素の退色を防ぐため、湿度の高い遮光箱または蓋付きのディッシュ/プレートに入れてください。

1. インキュベーションバッファーで60分間、サンプルをブロッキングしてください。
2. ブロッキングしている間に、データシートの記載に従って一次抗体を抗体希釈バッファーで希釈してください。
3. インキュベーション液を吸引除去し、希釈した一次抗体を加えてください。
4. 4℃で一晩インキュベートしてください。
5. PBSで各5分間、3回洗ってください。
   注意：Alexa Fluor^®蛍光色素で直接標識した一次抗体を用いる場合、ステップC8へ進んでください。
6. 検体にインキュベーションバッファーで希釈した蛍光色素標識二次抗体を加え、遮光して室温で1-2時間インキュベートしてください。
7. ステップ5と同様にPBSで洗ってください。
8. Prolong Gold Antifade Reagent (#9071) またはProlong Gold Antifade Reagent with DAPI#8961) を加え、カバーガラスで封入してください。
9. 最良の結果を得るために、直ちに適切な励起波長で染色像を観察してください。スライドを長期保存する際は、4°C、暗所で、水平にして保存してください。

*推奨二次抗体:

抗ウサギ

• Anti-Rabbit IgG (H+L)、 F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4412
• Anti-Rabbit IgG (H+L)、 F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4413
• Anti-Rabbit IgG (H+L)、 F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4414