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フローサイトメトリープロトコール (Flow)

重要:製品がフローサイトメトリー (F) を使用して検証され、使用可能であるかどうかについては、データシートまたは製品ウェブページの最初のページにあるApplicationsセクションをご参照ください。適切な固定、透過化条件、および推奨される抗体の希釈率は、製品ウェブページの製品特有のFlowプロトコールをご参照ください。

A. 溶液および試薬

注意:溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phospate Buffered Saline (PBS): (#9808):1X PBS 1 Lを調製する場合、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  2. 16%ホルムアルデヒド (メタノール不含)
  3. 100%メタノール (必要に応じて)
  4. インキュベーションバッファー:Bovine Serum Albumin (BSA) (#9998) 0.5 gを1X PBS 100 mLに溶解してください。4℃で保存してください。
  5. 二次抗体:Anti-mouse (#4408#8890#4410#8887)、Anti-rabbit (#4412#8889#4414#8885)、Anti-rat (#4416#4418)

B. 固定

注意:生細胞の染色が必要な場合は、免疫染色 (セクションD) に進んでください。抗体が生細胞染色へ使用できるかについては、製品ウェブページや製品ごとのプロトコールをご参照ください。

  1. 遠心分離で細胞を集め、上清を吸引してください。
  2. 細胞を1X PBS 0.5-1 mLで再懸濁してください。最終的な濃度が4%になるようにホルムアルデヒドを加えてください。
  3. 室温で15分間固定してください。
  4. 1X PBSをさらに加えて遠心分離し、細胞を洗ってください。上清は適切な廃棄容器に捨ててください。細胞を1X PBS 0.5-1 mLで再懸濁してください。

C. 透過化処理

注意:適切な透過化条件は、製品ウェブページ上の製品ごとのプロトコールをご参照ください。すべての製品がメタノールを用いた透過化を使用できるわけではありません。

  1. 予め冷やした細胞へ、穏やかにボルテックスしながら終濃度が90%になるように氷冷した100%メタノールをゆっくりと加えてください。
  2. 氷上で30分間インキュベートしてください。
  3. 免疫染色 (セクションD) を進めるか、細胞を90%メタノール中で-20°Cで保存してください。

D. 免疫染色

注意:細胞数を血球計算盤かその他の方法で計測してください。

  1. 必要な細胞数をチューブかウェルに分注してください。
  2. 必要に応じて、1X PBSをさらに加えて遠心分離することで細胞を洗い、メタノールを除去してください。上清は適切な廃棄容器に捨ててください。必要に応じて洗浄を繰り返してください。
  3. 細胞を一次抗体希釈液 (インキュベーションバッファーで推奨希釈率に調製済み) 100 µL中で再懸濁してください。
  4. 室温で1時間 (固定細胞) または氷上で15-30分間 (生細胞) インキュベートしてください。
  5. インキュベーションバッファーを加えて遠心分離し、細胞を洗ってください。上清を捨ててください。洗浄操作をもう一度繰り返してください。直接標識抗体を使用している場合は、ステップ9​へ進んでください。
  6. 細胞を蛍光標識二次抗体 (インキュベーションバッファーで推奨希釈率に調製済み) 100 µL中で再懸濁してください。
  7. 室温 (固定細胞) または氷上 (生細胞) で30分間インキュベートしてください。
  8. インキュベーションバッファーを加えて遠心分離し、細胞を洗ってください。上清を捨ててください。洗浄操作をもう一度繰り返してください。
  9. 1X PBS中で細胞を再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。DNA染色または生死判定のために、オプションでDNA染色 (セクションE) へ進んでください。

E. DNA染色 (固定細胞) と生死判定 (生細胞)

  1. 細胞をDNA色素 0.5 mLまたは生死判定色素 (e.g. Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087) で再懸濁してください。
  2. 室温 (固定細胞) または氷上 (生細胞) で5分間インキュベートしてください。
  3. 必要に応じて、PBSを加えて遠心分離することで洗ってください。細胞をフローサイトメーターで解析してください。

更新:2009年7月

改訂日:2017年7月

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