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免疫蛍光染色プロトコール (DOTMACによる透過化処理):

重要: データシート最初のページのアプリケーションセクションを参照し、製品が本プロトコールで検証され、推奨されているかどうかをご確認ください。

A. 溶液および試薬

注意:Milli-Qまたは同等の精製水で溶液を調製してください。

  • 10X Phosphate Buffered Saline (PBS): 1 Lを準備する場合は、塩化ナトリウム (NaCl) 80 g、塩化カリウム (KCl) 2 g、リン酸水素ナトリウム (Na2HPO4) 14.4 g、リン酸カリウム (KH2PO4) 2.4 gを精製水 (dH2O) 1 Lに溶解してください。pHを8.0に調整してください。
  • ホルムアルデヒド、16%、メタノール不含、Polysciences, Inc. (cat# 18814):新しい物を使用し、開封した瓶は暗所4°Cで保存し、使用の際はPBSで希釈してください。
  • Dodecyltrimethylammonium Chloride (DOTMAC)​、>97.0​%、TCI America (cat. # D1016):使用する際にPBSで溶解してください。
  • ブロッキングバッファー (1X PBS/5% Normal Goat Serum (#5425)):
    25 mLを調製する場合は、10X PBS 2.5 mL、二次抗体の免疫動物と同種の正常血清1.25 mL (例えば、正常ヤギ血清、正常ロバ血清) を精製水 (dH2O) 21.25 mLに加えてよく混ぜ合わせてください。
  • 抗体希釈バッファー (1X PBS/1% BSA):
    40 mLを調製する場合は、10X PBS 4 mLを精製水 (dH2O) 36 mLに加えて混ぜ合わせてください。0.4 gのBSAを加えてよく混ぜ合わせてください。
  • 蛍光色素標識二次抗体推奨される二次抗体
    注意:初めて一次抗体あるいは蛍光標識二次抗体をご使用になる際は、至適希釈率を決めるために抗体のタイトレーションを行ってください。
  • Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071) with DAPI (#8961)。

B. 試料作製 - 培養細胞株 (IF-IC)

注意:マルチウェルプレート、チェンバースライドあるいはカバーガラス上で直接細胞を培養、薬剤処理、固定および染色してください。

  1. 液を吸引除去し、細胞が2-3 mm浸る程度に、PBSで希釈した4%ホルムアルデヒドを加えてください。
    注意:ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフト内でのみ使用してください。
  2. 細胞を室温で15分間固定してください。
  3. 固定液を吸引除去し、PBSで各5分間、3回洗ってください。
  4. 免疫染色 (セクションC) に進んでください。

C. 免疫染色

注意:特に記載がない限り、下記全てのインキュベーションは室温で行い、乾燥と蛍光色素の退色を防ぐため、湿度の高い遮光箱または蓋付きのディッシュ/プレートに入れてください。

  1. DOTMACによる透過化のステップ:PBSで希釈した0.05%DOTMACを細胞が浸る程度に加えてください。室温で15分間インキュベートし、PBSで各5分間、3回洗ってください。
  2. ブロッキングバッファーでサンプルを60分間ブロッキングしてください。
  3. ブロッキングしている間に、データシートの記載に従って一次抗体を抗体希釈バッファーで希釈してください。
  4. ブロッキング液を吸引除去し、希釈した一次抗体を加えてください。
  5. 4℃で一晩インキュベートしてください。
  6. PBSで各5分間、3回洗ってください。
    注意:​​Alexa Fluor®蛍光色素で直接標識した一次抗体を用いる場合、ステップC8へ進んでください。
  7. 検体に抗体希釈バッファーで希釈した蛍光色素標識二次抗体*を加え、遮光して室温で1-2時間インキュベートしてください。
  8. ステップ7と同様にPBSで洗ってください。
  9. Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) with DAPI (#8961) を加え、カバーガラスで覆ってください。
  10. 最良の結果を得るために、直ちに適切な励起波長で染色像を観察してください。スライドを長期保存する際は、4°C、暗所で、水平にして保存してください。

*推奨二次抗体:

抗ウサギ

抗マウス

抗ラット

更新:2010年6月

改訂日:2010年12月

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