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免疫蛍光染色プロトコール (ゼラチンによるブロッキング)

重要： データシート最初のページのアプリケーションセクションを参照し、製品が本プロトコールで検証され、推奨されているかどうかをご確認ください。

A. 溶液および試薬

注意：Milli-Qまたは同等の精製水で溶液を調製してください。

  • 10X Phosphate Buffered Saline (PBS)： 1 Lを準備する場合は、塩化ナトリウム (NaCl) 80 g、塩化カリウム (KCl) 2 g、リン酸水素ナトリウム (Na2HPO4) 14.4 g、リン酸カリウム (KH2PO4) 2.4 gを精製水 (dH2O) 1 Lに溶解してください。pHを8.0に調整してください。
  • ホルムアルデヒド (16%、メタノール不含、Polysciences, Inc. (cat# 18814))：新しい物を使用し、開封した瓶は暗所4°Cで保存し、使用の際はPBSで希釈してください。
  • ​ゼラチン、2%、SIGMA (cat# G1393)
  • ブロッキングバッファー (1X PBS/0.2%ゼラチン)：
    25 mLを調製する場合は、10X PBS 2.5 mLと2%ゼラチン2.5 mLを精製水 (dH 2O) 20 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  • 抗体希釈バッファー (1X PBS/1% BSA/ 0.3% TritonX-100)：
    40 mLを調製する場合は、10X PBS 4 mLを精製水 (dH2O) 36 mLに加えて混ぜ合わせてください。0.4 gのBSAを加えてよく混ぜ合わせてください。撹拌しながら、Triton X-100 120 μLを加えてください。
  • 蛍光色素標識二次抗体（推奨される二次抗体）
    注意：初めて一次抗体あるいは蛍光標識二次抗体をご使用になる際は、至適希釈率を決めるために抗体のタイトレーションを行ってください。
  • Prolong Gold AntiFade Reagent (#9071) またはProlong Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)

B. 試料作製 - 培養細胞株 (IF-IC)

注意：マルチウェルプレート、チェンバースライドあるいはカバーガラス上で直接細胞を培養、薬剤処理、固定および染色してください。

  1. 培地を吸引除去し、4%ホルムアルデヒド (PBSで希釈) を細胞が2～3 mm浸る程度に加えてください。
    注意：ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフト内でのみ使用してください。
  2. 細胞を室温で15分間固定してください。
  3. 固定液を吸引除去し、PBSで各5分間、3回洗ってください。
  4. 免疫染色 (セクションC) に進んでください。

C. 免疫染色

注意：特に記載がない限り、下記全てのインキュベーションは室温で行い、乾燥と蛍光色素の退色を防ぐため、湿度の高い遮光箱または蓋付きのディッシュ/プレートに入れてください。

  1. ブロッキングバッファーでサンプルを60分間ブロッキングしてください。
  2. ブロッキングしている間に、データシートの記載に従って一次抗体を抗体希釈バッファーで希釈してください。
  3. ブロッキング液を吸引除去し、希釈した一次抗体を加えてください。
  4. 4℃で一晩インキュベートしてください。
  5. PBSで各5分間、3回洗ってください。
    注意：Alexa Fluor®蛍光色素で直接標識した一次抗体を用いる場合、ステップC8へ進んでください。
  6. 検体に抗体希釈バッファーで希釈した蛍光色素標識二次抗体*を加え、遮光して室温で1-2時間インキュベートしてください。
  7. ステップ5と同様にPBSで洗ってください。
  8. Prolong Gold Antifade Reagent (#9071) またはProlong Gold Antifade Reagent with DAPI#8961) を加え、カバーガラスで封入してください。
  9. 最良の結果を得るために、直ちに適切な励起波長で染色像を観察してください。スライドを長期保存する際は、4°C、暗所で、水平にして保存してください。

*推奨二次抗体:

抗ウサギ

抗マウス

抗ラット

更新：2010年12月

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