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免疫沈降プロトコール (ウェスタンブロッティングによる解析用)

アッセイ時間の短縮には磁気分離での免疫沈降プロトコール (ウェスタンブロッティングによる解析)をお試しください。

A. 溶液および試薬

注意:Milli-Qまたは同等の精製水で溶液を調製してください。

  1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS)
  2. 1X Cell Lysis Buffer: 20 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mM Sodium pyrophosphate、1 mM β-glycerophosphate、1 mM Na3VO4、1 μg/mL Leupeptin。Cell Lysis Buffer (10X) (#9803)。

注意:使用直前に1 mM PMSFを加えてください。

  1. Protein AまたはGアガロースビーズ: (Protein A #9863) メーカーの指示に従って用意してください。Rabbit IgGの免疫沈降にはProtein Aを、Mouse IgGの免疫沈降にはProtein Gを使用してください。
  2. 3X SDS sample buffer: 187.5 mM Tris-HCl (25°CでpH 6.8)、6% w/v SDS、30% グリセロール、150 mM DTT、0.03% w/v bromophenol blue。Blue Loading Buffer Pack (#7722)。

B. 細胞ライセートの調製

  1. 培地を吸引してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 未変性状態で細胞を回収する場合、培地を除去し、氷冷したPBSで細胞を1回洗ってください。
  3. PBSを除去し、氷冷した1X Cell Lysis Buffer 0.5 mLを各プレート (10 cm) に加え、氷上でプレートを5分間インキュベートしてください。
  4. プレートから細胞を掻き取り、遠心分離用チューブに移してください。氷上に保持してください。
  5. 氷上でサンプルを各5秒間、3回超音波処理してください。
  6. 14,000 x g、4°Cで10分間遠心分離して、上清を新しいチューブに移してください。必要に応じて、ライセートは–80°Cで保存することができます。

C. 免疫沈降

オプション: Protein A/G アガロースビーズへの非特異的結合を低減するために、ライセートのプレクリアステップを行う必要がある場合もあります (以下のセクションを参照してください)。

  1. 細胞ライセート200 μLを取り、一次抗体に加えてください。静かに振盪しながら4°Cで一晩インキュベートしてください。
  2. Protein AまたはGアガロースビーズ (50%ビーズスラリー20 μL) を加えてください。静かに振盪しながら4°Cで1-3時間インキュベートしてください。
  3. 4°Cで30秒間、遠心してください。ペレットを1X Cell Lysis Buffer 500 µLで5回洗ってください。洗いの操作は氷上で行ってください。
  4. ペレットを3X SDSサンプルバッファー20 μLで再懸濁してください。ボルテックスした後、30秒間遠心分離してください。
  5. サンプルを95–100°Cで2–5分間加熱し、14,000 x gで1分間遠心分離してください。
  6. サンプル (15-30 µL) をSDS-PAGEゲル (12–15%) にロードしてください。
  7. ウェスタンブロットでサンプルを解析してください (ウェスタンブロッティングプロトコールをご覧ください:Western BSAまたはWestern 脱脂粉乳)。

細胞ライセートのプレクリア (オプション)

  1. 細胞ライセートを200 μL取り、Protein AまたはGアガロースビーズ (50%ビーズスラリー20 μL) へ加えてください。
  2. 4°Cで30-60分間インキュベートしてください。
  3. 4°Cで10分間、遠心分離してください。上清を新しいチューブに移してください。
  4. 免疫沈降のステップ1に進んでください。

注意:分子量が50 kDaのタンパク質は、変性した重鎖によるマスキングを最小化するために、Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb #3677あるいはMouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb #3678を二次抗体として使用することをお勧めします。分子量25 kDaのタンパク質には、Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb #3678をお勧めします。

更新:2006年11月

改訂日:2012年1月

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