ただ今実施中のプロモーション | 詳細はこちら >>

KinomeView®プロトコール

次の製品の専用プロトコールです: KinomeView™ Profiling Kit #9812

注意:KinomeView™キットに含まれる抗体は全て、ウェスタンブロットに用いた場合、化学発光-X線フィルムで検出できることが確認されています。しかし高分解能イメージングが必要な場合は、LI-COR® Odyssey®システムでイメージングすることをお薦めします。

A. SDS-PAGE:

ウェスタンブロット解析には、通常プレキャスト4-20%ゲルを使用しています。

注意:プレキャストゲルは、なるべく新しいものを使用してください (製造日より4週以内) 。経験上、8週間を超えるプレキャストPAGEゲルを用いると、結果に悪影響を及ぼすことがあります。

B. 溶液および試薬

注意:Milli-Qまたは同等の精製水で溶液を調製してください。

  • ​Cell Lysis Buffer (10X) #9803
  • SDSサンプルバッファー (3X):Blue Loading Buffer Pack #7722またはRed Loading Buffer Pack #7723
  • 転写バッファー: 25 mM Tris base、0.2 Mグリシン、20%メタノール (pH 8.5)
  • 10X Tris Buffered Saline (TBS): 10X TBSを1 L調製する場合、Tris base ​24.2 g、NaCl 80 gを精製水に溶解し、HClでpHを7.6に調節してください (1X で使用)
  • 10X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997
  • 脱脂粉乳#9999
  • ブロッキングバッファー (X線フィルム): 5% w/v 脱脂粉乳を含むTBST (0.1% Tween-20含有1X TBS)
  • ブロッキングバッファー (LI-COR®): 5% w/v 脱脂粉乳を含む1X TBS
  • 洗浄バッファー:0.1% Tween-20を含む1X TBS (TBST)
  • ウシ血清アルブミン (BSA) #9998
  • 一次抗体希釈バッファー: 5% BSAを含むTBST (0.1% Tween-20含有1X TBS)
  • 化学発光の検出システム (二次抗体が含まれています) : Phototope®-HRP Western Blot Detection System, Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7071および、Phototope®-HRP Western Blot Detection System, Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7072 ( 本製品にはBiotinylated Protein Ladder Detection Pack #7727、​Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074​またはAnti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076​、Anti-biotin, HRP-linked Antibody #7075​、20X LumiGLO® Reagent and 20X Peroxide #7003​が含まれます)
  • DyLight®標識二次抗体: Anti-mouse IgG (H+L) (DyLight® 680​ Conjugate) #5470、anti-mouse IgG (H+L) (DyLight® 800 Conjugate) #5257、anti-rabbit IgG (H+L) (DyLight® 680 Conjugate) #5366​、anti-rabbit IgG (H+L) (DyLight® 800​ Conjugate) #5151
  • Prestained Protein Marker, Broad Range (Premixed Format) #7720
  • 転写膜:このプロトコールはニトロセルロース転写膜を用いて最適化されています

C.サンプル調製とSDS-PAGEの泳動

  1. 培養細胞または組織サンプルを1XのCell Lysis Buffer (10X) #9803で溶解し、ライセートを超音波処理してください。不溶性の細胞デブリを沈殿させるため、ライセートを遠心分離してください。
  2. ライセートのタンパク質濃度を確認してください。SDS-PAGEローディングバッファー内で、ライセートのタンパク質濃度を1 – 2 µg/µLに調整することにより、ローディングストックを調製してください。
  3. SDS-PAGEの各レーンに20 – 30 µgのタンパク質ライセート (10 – 20 µL) をロードしてください。X線フィルムを使用する場合、5 µLのPrestained Protein MarkerおよびBiotinylated Protein Ladderもそれぞれ1つのレーンにロードしてください。LI-COR® Odyssey®システムを使用している場合、5 µLのPrestained Protein Markerもレーンの1つにロードしてください。色素がゲルの底に到達するまで、130​ Vで電気泳動してください。
    注意:Biotinylated Protein Ladderは抗ビオチン抗体で検出できます。Prestained Protein MarkerはLI-COR® Odyssey®システムで自家蛍光が検出されます。
  4. ニトロセルロース転写膜に転写してください。

D. 転写膜のブロッキングと抗体インキュベーション

I. 転写膜のブロッキング

  1. 検出系に対応したブロッキングバッファー 中で、転写膜を緩やかに振盪しながら1時間室温でインキュベートしてください。
  2. TBS/Tで軽く洗ってください。

II. 一次抗体反応

  1. 一次抗体反応液 (一次抗体原液を一次抗体希釈バッファーで1:1000希釈) 中で、転写膜を4°Cで一晩緩やかに振盪しながらインキュベートしてください。
  2. TBS/Tで各5分間、3回洗ってください。

III. 二次抗体反応:

X線フィルム:

  1. 二次抗体反応液 (一次抗体の免疫動物種に対応したHRP標識二次抗体をブロッキングバッファーに1:2000希釈して調製してください。ビオチン標識プロテインマーカーの検出も行う場合はさらに、Anti-biotin, HRP-linked Antibody #7075を1:1000希釈で加えてください。) 中で、転写膜を1時間室温でインキュベートしてください。
  2. TBS/Tで各5分間、3回洗ってください。
  3. セクションEの検出ステップへ進んでください。

LI-COR® Odysseyシステム:

  1. 二次抗体反応液 (一次抗体の免疫動物種に対応した色素標識二次抗体をLI-COR®ブロッキングバッファーで1:10,000希釈して調製してください) 中で、転写膜を緩やかに振盪しながら1時間室温でインキュベートしてください。
  2. TBS/Tで各5分間、3回洗ってください。
  3. 転写膜を室温で乾燥させてください。転写膜を乾燥した後はすぐに検出することができますが、室温で保存した後に検出することもできます。

E. タンパク質の検出

X線フィルム:

  1. 転写膜をLumiGLO® 10 mL (20X LumiGLO® 0.5 mL、20X Peroxide 0.5 mL、Milli-Q水 9.0 mL) 中で緩やかに振盪しながら、室温で1分間インキュベートしてください。
    注意:反応が速すぎる場合は、LumiGLO®基質をさらに希釈して使用してください。
  2. 転写膜の余分な液を除去し (この時、乾燥させないようにご注意ください)、ラップで包んでX線フィルムに露光してください。初めに10秒間の露光をして、適度な露光時間を予測することができます。
    注意:検出反応の速度論に従い、シグナルはLumiGLO®インキュベーション開始直後が最も強く、2時間かけて減退します。

LI-COR® Odyssey®システム:

  1. 転写膜をOdyssey® 赤外イメージングシステムで読み取ります。

LumiGLO®は、Kirkegaard & Perry Laboratoriesの登録商標です。
LI-COR®およびOdyssey®は、LI-COR Biosciencesの登録商標です。
DyLight®はThermo Fisher Scientific, Inc.およびその子会社の登録商標です。

更新:2011年3月

Powered by Translations.com GlobalLink OneLink SoftwarePowered By OneLink