KinomeView^®プロトコール

次の製品の専用プロトコールです： KinomeView® Profiling Kit #9812

注意：KinomeView®キットに含まれる抗体は全て、ウェスタンブロットに用いた場合、化学発光-X線フィルムで検出できることが確認されています。しかし、高分解能イメージングが必要な場合は、LI-COR Odysseyシステムでイメージングすることをお薦めします。

A. SDS-PAGE：

ウェスタンブロット解析には、通常プレキャスト4-20%ゲルを使用しています。

注意：プレキャストゲルは、なるべく新しいものを使用してください (製造日より4週以内) 。経験上、8週間を超えるプレキャストPAGEゲルを用いると、結果に悪影響を及ぼすことがあります。

B. 溶液および試薬

注意：Milli-Qまたは同等の精製水で溶液を調製してください。

Cell Lysis Buffer (10X) #9803
SDSサンプルバッファー (3X)：Blue Loading Buffer Pack #7722またはRed Loading Buffer Pack #7723
転写バッファー： 25 mM Tris base、0.2 Mグリシン、20%メタノール (pH 8.5)
10X Tris Buffered Saline (TBS) 10X TBSを1 L調製する場合、Tris base 24.2 g、NaCl 80 gを精製水に溶解し、HClでpHを7.6に調節してください (1X で使用)
10X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997
脱脂粉乳#9999
ブロッキングバッファー (X線フィルム)： 5% w/v 脱脂粉乳を含むTBST (0.1% Tween-20含有1X TBS)
ブロッキングバッファー (LI-COR)： 5％ w/v 脱脂粉乳を含む1X TBS
洗浄バッファー： 0.1% Tween-20を含む1X TBS (TBST)
ウシ血清アルブミン (BSA) #9998
一次抗体希釈バッファー： 5% BSAを含むTBST (0.1% Tween-20含有1X TBS)
化学発光の検出システム (二次抗体が含まれています) ： Phototope^®-HRP Western Blot Detection System, Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7071および、Phototope^®-HRP Western Blot Detection System, Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7072 ( 本製品には、Biotinylated Protein Ladder Detection Pack #7727; Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074; Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076、Anti-biotin, HRP-linked Antibody #7075、20X LumiGLO Reagent and 20X Peroxide #7003が含まれています。
DyLight標識二次抗体: Anti-mouse IgG (H+L) (DyLight 680 Conjugate) #5470; Anti-mouse IgG (H+L) (DyLight 800 Conjugate) #5257; Anti-rabbit IgG (H+L) (DyLight 680 Conjugate) #5366; Anti-rabbit IgG (H+L) (DyLight 800 Conjugate) #5151。
Prestained Protein Marker, Broad Range (Premixed Format) #7720
転写膜：このプロトコールはニトロセルロース転写膜を用いて最適化されています

C.サンプル調製とSDS-PAGEの泳動

培養細胞または組織サンプルを1XのCell Lysis Buffer (10X) #9803で溶解し、ライセートを超音波処理してください。不溶性の細胞デブリを沈殿させるため、ライセートを遠心分離してください。
ライセートのタンパク質濃度を確認してください。SDS-PAGEローディングバッファー内で、ライセートのタンパク質濃度を1 – 2 µg/µLに調整することにより、ローディングストックを調製してください。
SDS-PAGEの各レーンに20 – 30 µgのタンパク質ライセート (10 – 20 µL) をロードしてください。X線フィルムを使用する場合、5 µLのPrestained Protein MarkerおよびBiotinylated Protein Ladderもそれぞれ1つのレーンにロードしてください。LI-COR Odysseyシステムを使用している場合、5 µLのPrestained Protein Markerもレーンの1つにロードしてください。色素がゲルの底に到達するまで、130 Vで電気泳動してください。
注意：ビオチン標識されたマーカーは、抗ビオチン抗体で検出できます。事前染色されたタンパク質マーカーは、LI-COR Odysseyシステムで自家蛍光が検出されます。
ニトロセルロース転写膜に転写してください。

D. 転写膜のブロッキングと抗体インキュベーション

I. 転写膜のブロッキング

検出系に対応したブロッキングバッファー中で、転写膜を緩やかに振盪しながら1時間室温でインキュベートしてください。
TBS/Tで軽く洗ってください。

II. 一次抗体反応

一次抗体反応液 (一次抗体原液を一次抗体希釈バッファーで1：1000希釈) 中で、転写膜を4°Cで一晩緩やかに振盪しながらインキュベートしてください。
TBS/Tで各5分間、3回洗ってください。

III. 二次抗体反応：

X線フィルム：

二次抗体反応液 (一次抗体の免疫動物種に対応したHRP標識二次抗体をブロッキングバッファーに1：2000希釈して調製してください。ビオチン標識プロテインマーカーの検出も行う場合はさらに、Anti-biotin, HRP-linked Antibody #7075を1:1000希釈で加えてください。) 中で、転写膜を1時間室温でインキュベートしてください。
TBS/Tで各5分間、3回洗ってください。
セクションEの検出ステップへ進んでください。

LI-COR Odysseyシステム:

二次抗体反応液 (一次抗体の免疫動物種に対応した色素標識二次抗体をLI-CORブロッキングバッファーで1:10,000希釈して調製してください) 中で、転写膜を緩やかに振盪しながら1時間室温でインキュベートしてください。
TBS/Tで各5分間、3回洗ってください。
転写膜を室温で乾燥させてください。転写膜を乾燥した後はすぐに検出することができますが、室温で保存した後に検出することもできます。

E. タンパク質の検出