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このテクニカルレポートをお使いになる前に、CSTのクロマチン免疫沈降 (ChIP) トラブルシューティングガイドを参照されましたか?
一般的なご質問
- 製品のカタログ番号 (ChIPキットおよび/または抗体)
- 製品バイアルに印刷されているロット番号とリファレンスデイト
クロマチンの調製
- 細胞種と (薬剤などの) 処理条件、接着細胞 or 浮遊細胞
- クロマチン調製に用いた合計細胞数と細胞数のカウント方法
- 固定時間とホルムアルデヒド濃度
- ヌクレアーゼ消化条件 (時間、温度、加えたヌクレアーゼ量、消化物の総容量)
- 1X ChIP Buffer中でペレットを溶解した後の、氷上での静置時間
- ソニケーション処理条件 (パルス数、各パルスで超音波処理した時間、およびパルス間の氷上の静置時間)
- ソニケーターのモデル (プローブサイズとソニケーション処理設定を含む)
- 精製されたクロマチンDNAサンプルの濃度 (プロトコールのセクションBを参照してください)
クロマチン免疫沈降 (ChIP)
- IPに用いた抗体と、IPごとに用いた抗体量 (μg or μL)、抗体の由来、および抗体がIPまたはChIPに対して検証済みであるか否か
- 各IPに加えたクロマチン量 (μg)
- 抗体とクロマチンのインキュベーション時間
- 使用したProtein Gビーズのタイプ (磁気 or アガロース)
- ビーズとのインキュベーション時間
- 溶出条件 (時間、温度)
- 脱クロスリンクの条件 (時間、温度)
IP産物の検出および定量
- 定量の方法 (半定量PCR、定量的PCR、ChIP-on-chip、ChIPシーケンシング)
- PCRサイクルの回数と、解析した標的DNAの遺伝子座
- PCR分析で、用いたプライマーのセットに対して、2%インプットDNAの段階希釈サンプルを使用したか (セクションG、ステップ1)?
- 段階希釈したインプットDNAを用いたPCRで、このプライマーのセットを用いた際に、線形性を示したか?
- 使用したプライマーセットで計算したPCR効率 (定量的PCRのユーザーのみ)
- コントロールのHistone H3 Antibody (#4620) を用いた際に、コントロールのRPL30プロモーターは濃縮されたか? この時濃縮された量のインプットクロマチン総量 (IP反応に加えた量) に対する割合 (%)
- Normal Rabbit IgG (#2729) を用いて濃縮されたRPL30プロモーターの濃縮量のインプットクロマチン総量に対する割合 (%)
- コントロールのHistone H3 Antibody (#4620) を用いた際に、ターゲットの遺伝子座が濃縮されたか? 濃縮された量のインプットクロマチン総量に対する割合 (%)
- Normal Rabbit IgG (#2729) を用いて濃縮された (お客様が解析されている) 標的遺伝子座の濃縮量のインプットクロマチン総量に対する割合 (%)
- 用いた抗体は標的遺伝子座を濃縮したか？この時、濃縮された量のインプットクロマチン総量に対する割合 (%)
