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73916
DYKDDDDK Tag (D6W5B) Rabbit mAb (Binds to same epitope as Sigma's Anti-FLAG® M2 Antibody) (PE-Cy7® Conjugate)
標識抗体
モノクローナル抗体

DYKDDDDK Tag (D6W5B) Rabbit mAb (Binds to same epitope as Sigma's Anti-FLAG® M2 Antibody) (PE-Cy7® Conjugate) #73916

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Flow cytometric analysis of 293 cells, wild-type (blue) or stably transfected with DYKDDDDK-Tag (green), using DYKDDDDK Tag (D6W5B) Rabbit mAb (Binds to same epitope as Sigma's Anti-FLAG® M2 Antibody) (PE-Cy7® Conjugate) (solid lines) or concentration-matched Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (PE-Cy7® Conjugate) #97492 (dashed lines).

To Purchase # 73916S
製品番号 サイズ 価格 在庫
73916S
100 µl  (50 tests)

Supporting Data

REACTIVITY All
SENSITIVITY Transfected Only
MW (kDa)
Source/Isotype Rabbit IgG

Application Key:

  • W-Western
  • IP-Immunoprecipitation
  • IHC-Immunohistochemistry
  • ChIP-Chromatin Immunoprecipitation
  • IF-Immunofluorescence
  • F-Flow Cytometry
  • E-P-ELISA-Peptide

Species Cross-Reactivity Key:

  • H-Human
  • M-Mouse
  • R-Rat
  • Hm-Hamster
  • Mk-Monkey
  • Mi-Mink
  • C-Chicken
  • Dm-D. melanogaster
  • X-Xenopus
  • Z-Zebrafish
  • B-Bovine
  • Dg-Dog
  • Pg-Pig
  • Sc-S. cerevisiae
  • Ce-C. elegans
  • Hr-Horse
  • All-All Species Expected

Product Description

This Cell Signaling Technology antibody is conjugated to phycoerythrin-cyanine 7 (PE-Cy7®) and tested in-house for direct flow cytometric analysis in human cells. This antibody is expected to exhibit the same species cross-reactivity as the unconjugated DYKDDDDK Tag (D6W5B) Rabbit mAb (Binds to same epitope as Sigma's Anti-FLAG® M2 Antibody) #14793.

製品概要

アプリケーション 希釈率
フローサイトメトリー 1:50

保存

Supplied in PBS (pH 7.2), less than 0.1% sodium azide and 2 mg/ml BSA. 4℃で保存してください。Do not aliquot the antibody. 遮光してください。Do not freeze.

プロトコール

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フローサイトメトリー (メタノールによる透過化プロトコール、直接標識した一次抗体)

A. 溶液および試薬

本プロトコールに必要なすべての試薬は、Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593でまとめてセットとしてご購入いただけます。下に記載されているカタログ番号から個別にご購入いただくこともできます。

注意​:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS):1X PBSを1L調製する場合は、10X PBS (#12528) 100 mLを精製水900 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  2. 4%ホルムアルデヒド、メタノール不含 (#47746)
  3. 100% Methanol (#13604):使用前に氷冷してください
  4. 抗体希釈バッファー:調製済みのFlow Cytometry Antibody Dilution Buffer (#13616) を購入いただくか、ウシ血清アルブミン (BSA) (#9998) 0.5 gを100 mLの1X PBSに溶解して0.5%のBSA PBSバッファーを調製してください。4℃で保存してください。

注意:実験に蛍光細胞染色色素 (生死判別色素、DNA色素など) を使用する場合は、色素の製品ページの推奨プロトコールを参照してください。フローサイトメトリーでの使用が検証済みの細胞染色色素の一覧はwww.cellsignal.com/flowdyesをご覧ください。

B. 固定

注意:接着細胞や組織は固定操作の前に十分に解離させ、単一細胞の懸濁液にする必要があります。

注意:遠心分離の最適条件は細胞のタイプと試薬の容量によって異なります。一般的には、150-300 gで1-5分間で細胞を十分にペレット化することができます。

注意​:全血を用いる場合は、固定の前に赤血球を溶解し、遠心分離により洗ってください。

注意:CDマーカーやその他細胞外タンパク質を標的とする抗体について、エピトープがホルムアルデヒドやメタノールで破壊される場合は、抗体反応を固定操作の前に行うことがあります。この場合、抗体が標的に結合したままの状態で固定と透過化プロセスを行います。ただし、一部の蛍光色素 (PEやAPC) はメタノールで損傷を受けますので、透過化の前に加えないでください。初めて行う実験については、スモールスケールで予備実験を行うことをお勧めします。

  1. 遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去してください。
  2. 100万細胞当たり100 µLの4%ホルムアルデヒドを加え、再懸濁してください。個々の細胞どうしがクロスリンクされないように、ペレットをよくほぐしてください。
  3. 室温 (20-25℃) で15分間固定してください。
  4. 1X PBSをさらに加えて遠心分離し、細胞を洗ってください。上清は適切な廃棄容器に捨ててください。細胞を1X PBS 0.5-1 mLで再懸濁してください。透過化の手順に進んでください。
    1. または、1X PBSに懸濁した細胞を4°Cで一晩保存することもできます。

C. 透過化処理

  1. 予め冷やした細胞へ、穏やかにボルテックスしながら終濃度が90%になるように氷冷した100%メタノールをゆっくりと加えてください。
  2. 氷上に最低10分間静置し、透過化してください。
  3. 免疫染色 (セクションD) を進めるか、細胞を90%メタノール中で-20°Cで保存してください。

D. 免疫染色

注意​:血球計算盤または代替の方法により細胞数を測定してください。

  1. 必要な細胞数をチューブかウェルに分注してください。(通常、アッセイごとに5x105-1x106細胞が必要です。)
  2. 過剰量の1X PBSで細胞を洗浄し、メタノールを除いてください。上清は適切な廃棄容器に捨ててください。必要に応じて洗浄を繰り返してください。
  3. 細胞を一次抗体反応液100 µLに再懸濁してください。(一次抗体反応液は抗体原液を抗体希釈バッファーで希釈して調製してください。希釈率は製品データシートの推奨希釈率に従うか、タイトレーションを行って決定してください。)
  4. 室温で1時間インキュベートしてください。遮光してください。
  5. 抗体希釈バッファーまたは1X PBS中で遠心分離して洗浄してください。上清を捨ててください。洗浄操作をもう一度繰り返してください。
  6. 細胞を1X PBS 200-500 µLに再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。

更新:2009年7月

改訂日:2019年8月

Protocol Id: 407

特異性 / 感度

DYKDDDDK Tag (D6W5B) Rabbit mAb (PE-Cy7® Conjugate) detects exogenously expressed DYKDDDDK proteins in cells. The antibody recognizes the DYKDDDDK peptide, which is the same epitope recognized by Sigma's Anti-FLAG® antibodies, fused to either the amino-terminus or carboxy-terminus of the target protein.

Species Reactivity:

All Species Expected

使用抗原 / 精製方法

Monoclonal antibody is produced by immunizing animals with a synthetic DYKDDDDK peptide.

バックグラウンド

Epitope tags are useful for the labeling and detection of proteins using immunoblotting, immunoprecipitation, and immunostaining techniques. Because of their small size, they are unlikely to affect the tagged protein’s biochemical properties.

The DYKDDDDK peptide has been used extensively as a general epitope tag in expression vectors. This peptide can be expressed and detected with the protein of interest as an amino-terminal or carboxy-terminal fusion (1).

  1. Brizzard, B. L. et al. (1994) Biotechniques 16, 730-735.
研究用のみ。診断手順では使用しません。

Cell Signaling Technology is a trademark of Cell Signaling Technology, Inc.
XPはCell Signaling Technology, Inc.の商標です。
Anti-FLAGはSigma-Aldrich Biotechnologyの登録商標です。
Cy and CyDye are registered trademarks of GE Healthcare.

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