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47538
SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers)
ChIPキット & 関連製品
ChIP Kit

SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538

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47538S
1 Kit  (96 assays)

Product Includes Volume (with Count) Storage Temp
Adaptor for Illumina® 1 x 960 µl -20°C
USER® Enzyme 1 x 288 µl -20°C
Index Primer Orange Tube Caps 1 x 24 ea RT
Index Primer White Tube Caps 1 x 16 ea RT
Index 501 Primer for Illumina® 1 x 60 µl -20°C
Index 502 Primer for Illumina® 1 x 60 µl -20°C
Index 503 Primer for Illumina® 1 x 60 µl -20°C
Index 504 Primer for Illumina® 1 x 60 µl -20°C
Index 505 Primer for Illumina® 1 x 60 µl -20°C
Index 506 Primer for Illumina® 1 x 60 µl -20°C
Index 507 Primer for Illumina® 1 x 60 µl -20°C
Index 508 Primer for Illumina® 1 x 60 µl -20°C
Index 701 Primer for Illumina® 1 x 40 µl -20°C
Index 702 Primer for Illumina® 1 x 40 µl -20°C
Index 703 Primer for Illumina® 1 x 40 µl -20°C
Index 704 Primer for Illumina® 1 x 40 µl -20°C
Index 705 Primer for Illumina® 1 x 40 µl -20°C
Index 706 Primer for Illumina® 1 x 40 µl -20°C
Index 707 Primer for Illumina® 1 x 40 µl -20°C
Index 708 Primer for Illumina® 1 x 40 µl -20°C
Index 709 Primer for Illumina® 1 x 40 µl -20°C
Index 710 Primer for Illumina® 1 x 40 µl -20°C
Index 711 Primer for Illumina® 1 x 40 µl -20°C
Index 712 Primer for Illumina® 1 x 40 µl -20°C

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Upon receipt, #54631 and #70942 tube caps should be removed from the kit box and stored at room temperature. Store remaining components at -20ºC. This product is stable for 12 months if stored properly.

プロトコール

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SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) プロトコール

Next generation sequencing (NG-seq) is a high throughput method that can be used
downstream of chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays to identify and quantify target
DNA enrichment across the entire genome. SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for
Illumina® (Dual Index Primers) contains adaptors and primers that are ideally suited for
multiplex sample preparation for NG-seq on the Illumina® platform (Illumina, Inc.). This
kit can be used to generate up to 96 distinct, barcoded ChIP-seq DNA libraries that can be
combined into a single sequencing reaction.

Each kit component must pass rigorous quality control standards, and for each new lot the
entire set of reagents is functionally validated together by construction and sequencing of
indexed libraries on the Illumina® sequencing platform.

This product provides enough reagents to support up to 96 DNA sequencing libraries,
and must be used in combination with SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for
Illumina® #56795.

Compatible SimpleChIP® kits:
SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003
SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005
SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383
SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795

Non-Compatible SimpleChIP® kits:
SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002
SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004
Note: Agarose beads are blocked with sonicated salmon sperm DNA, which will contami-
nate DNA library preps and NG-seq.

Required Reagents:
Reagents Included:

  1. (赤) Adaptor for Illumina® #42436
  2. (赤) USER Enzyme #59713
  3. º (白) Index 501 Primer for Illumina® #86676
  4. º (白) Index 502 Primer for Illumina® #92596
  5. º (白) Index 503 Primer for Illumina® #29576
  6. º (白) Index 504 Primer for Illumina® #46325
  7. º (白) Index 505 Primer for Illumina® #67343
  8. º (白) Index 506 Primer for Illumina® #89663
  9. º (白) Index 507 Primer for Illumina® #27649
  10. º (白) Index 508 Primer for Illumina® #40566
  11. (オレンジ) Index 701 Primer for Illumina® #60797
  12. (オレンジ) Index 702 Primer for Illumina® #79999
  13. (オレンジ) Index 703 Primer for Illumina® #18697
  14. SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) プロトコール

    Next generation sequencing (NG-seq) is a high throughput method that can be used
    downstream of chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays to identify and quantify target
    DNA enrichment across the entire genome. SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for
    Illumina® (Dual Index Primers) contains adaptors and primers that are ideally suited for
    multiplex sample preparation for NG-seq on the Illumina® platform (Illumina, Inc.). This
    kit can be used to generate up to 96 distinct, barcoded ChIP-seq DNA libraries that can be
    combined into a single sequencing reaction.

    Each kit component must pass rigorous quality control standards, and for each new lot the
    entire set of reagents is functionally validated together by construction and sequencing of
    indexed libraries on the Illumina® sequencing platform.

    This product provides enough reagents to support up to 96 DNA sequencing libraries,
    and must be used in combination with SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for
    Illumina® #56795.

    Compatible SimpleChIP® kits:
    SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003
    SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005
    SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383
    SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795

    Non-Compatible SimpleChIP® kits:
    SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002
    SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004
    Note: Agarose beads are blocked with sonicated salmon sperm DNA, which will contami-
    nate DNA library preps and NG-seq.

    Required Reagents:
    Reagents Included:

    1. (赤) Adaptor for Illumina® #42436
    2. (赤) USER Enzyme #59713
    3. º (白) Index 501 Primer for Illumina® #86676
    4. º (白) Index 502 Primer for Illumina® #92596
    5. º (白) Index 503 Primer for Illumina® #29576
    6. º (白) Index 504 Primer for Illumina® #46325
    7. º (白) Index 505 Primer for Illumina® #67343
    8. º (白) Index 506 Primer for Illumina® #89663
    9. º (白) Index 507 Primer for Illumina® #27649
    10. º (白) Index 508 Primer for Illumina® #40566
    11. (オレンジ) Index 701 Primer for Illumina® #60797
    12. (オレンジ) Index 702 Primer for Illumina® #79999
    13. (オレンジ) Index 703 Primer for Illumina® #18697
    14. (オレンジ) Index 704 Primer for Illumina® #26125
    15. (オレンジ) Index 705 Primer for Illumina® #39467
    16. (オレンジ) Index 706 Primer for Illumina® #51808
    17. (オレンジ) Index 707 Primer for Illumina® #58724
    18. (オレンジ) Index 708 Primer for Illumina® #65787
    19. (オレンジ) Index 709 Primer for Illumina® #75272
    20. (オレンジ) Index 710 Primer for Illumina® #99422
    21. (オレンジ) Index 711 Primer for Illumina® #10812
    22. (オレンジ) Index 712 Primer for Illumina® #38569
    23. Index Primer Orange Tube Caps #54631
    24. Index Primer White Tube Caps #70942

    含まれない試薬:

    1. ChIP Illumina®ライブラリー用に最適な酵素とバッファー:SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795に含まれています。
    2. Nuclease-free Water #12931
    3. AMPure® XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881) またはSPRIselect® Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317)
    4. 用時調製した80%エタノール
    5. 1X TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM EDTA)
    6. 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)
    7. Magnetic Separation Rack #7017/#14654
    8. Bioanalyzer®とAgilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Inc.)、PCR
      tubes and PCR

    I. ロープレックスでサンプルをプールする場合のガイドライン:

    デュアルインデックスプライマー方式では、それぞれに8塩基のインデックス配列をもつ、2種類のプライマーを使用します。Index 7 primerは、P7シーケンスに隣接するインデックスを含み、一方、Index 5 primerは、P5シーケンスに隣接するインデックスを含みます。デュアルインデックスでは、シーケンスサンプルの両末端に固有のインデックスを付加します。12種類のIndex 7 primerと、8種類のIndex 5 primerとを組み合わせることで、最大96までの異なるサンプルを固有にインデックス化することができます。

    Illumina® NG-seqプラットフォームでは、A/Cのシーケンスには赤色レーザ/LEDを、G/Tのシーケンスには緑色レーザー/LEDを使用しています。各サイクルにつき、赤と緑の両方のチャンネルで読み取り、適切なイメージのレジストレーションをおこなう必要があります (すなわち、各サイクルでAかCが存在し、各サイクルでGかTが存在する必要があります)。インデックスリードのシーケンシングの際、この色のバランスが保たれていないと、失敗の原因となります。各インデックスのシーケンスをチェックして、各サイクルに対して赤と緑両方のチャネルでシグナルを持つインデックスが使用されているかどうかを確認してください。以下の例をご参照ください:

    ChIPプロトコール表1

    ChIPプロトコール表2

    下の表は、一緒にシーケンスすることができる、有効なインデックスの組み合わせの一部 (すべてではありません) を、リスト化したものです。

    ChIPプロトコール表3

    その他有効な組み合わせを下にリスト化しました。Index 7 primnerと有効なセットと、Index 5 primerの有効なセットを選択してください。Index 5 primerとIndex 7 primerを組み合わせて、必要とするライブラリー数に応じて、PCRに必要なプライマーセットを選定してください。

    ChIPプロトコール表4

    II. Index 5 Primers for Illumina®

    各Index 5 Primer for Illumina®は、60 µLの容量で提供されています。

    ChIPプロトコール表5

    -s-はホスホロチオエート結合を示しています。

    III. Index 7 Primers for Illumina®

    各Index 7 Primer for Illumina®は40 µLの容量で提供されています。

    ChIPプロトコール表6

    -s-はホスホロチオエート結合を示しています。

    IV. PCR反応の設定

    1. Index 7 primerとIndex 5 primerの有効な組み合わせが成されていることを確認してください。正しいプライマー選択が行われていることの確認はセクションIとIIをご参照ください。
    2. 各PCRチューブには、Index 5 primer (º) (5 µL) とIndex 7 primer () (5 µL) を、それぞれ1種づつのみ加えてください。クロスコンタミネーションを避けるために、チューブ間でチップを換えることが重要です。必要に応じて、元のインデックス5の白キャップ、またはインデックス7のオレンジキャップを破棄して、クロスコンタミネーションを避けるために新しいキャップを使用してください。
    3. 各PCRチューブに加えたIndex 5 primerとIndex 7 primerを記録してください。
    4. Q5® PCR Master Mix () 25 µLをプライマーを含む各チューブに加えてください。
    5. アダプターを連結したDNA 15 µLを、最終容量50 µLになるように対応するチューブに加えてください。ピペッティングにより、5–10回穏やかに上下させて、混ぜ合わせてください。クロスコンタミネーションを避けるために、サンプル間でチップ交換することが重要です。
    6. PCRチューブに、加えたDNAサンプル (アダプターを連結したDNA) を記録しておいてください。
    7. 軽く遠心し、推奨のサイクル条件に従ってPCRを実行してください (SimpleChIP®ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795用プロトコールを参照してください)。

    APPENDIX:キット構成品の品質管理

    SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538​の構成品は、以下に記載された機能テストによって個々に検証されており、厳格な品質管理基準を満たしています。さらに、インデックス化されたライブラリーの調製を行い、Illumina®シーケンシングプラットフォームで シーケンシング解析を行うことで、構成品の各セットが機能することを確認しています。

    I. Adaptor for Illumina® (15 µM) ()

    5´-/5Phos/GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT C/ideoxyU/A CAC TCT TTC CCT ACA CGA CGC TCT TCC GAT C-s-T-3´

    品質管理アッセイ

    1. 16時間のインキュベーション:本アダプターとHindIII消化したLambda DNA 1 μgを含む反応液50 μLを、37℃で16時間インキュベートした場合には、アガロースゲル電気泳動で検出可能な非特異的ヌクレアーゼ分解はみられません。1X 濃度の反応バッファーとT3 DNA 1 μgを含む反応液50 μLを37℃で16時間インキュベートした場合も同様に、アガロースゲル電気泳動で検出可能な非特異的ヌクレアーゼ分解はみられません。
    2. エンドヌクレアーゼ活性:本アダプターを最低5 µLと、φX174 RF 1 DNA 1 µgを混合し、37℃で4時間インキュベートした場合 (反応液50 µL)、アガロースゲル電気泳動で検出されるRF II (ニック分子) への変換は10%未満となります。
    3. ホスファターゼ活性:本アダプターを最低10 µLと、2.5 mM p-ニトロフェニルリン酸 (pNPP) を混合し、タンパク質ホスファターゼアッセイバッファー (1 M ジエタノールアミンpH 9.8、0.5 mM MgCl2) 中でインキュベート (37℃、4時間) した場合、分光測色法 (405 nm) で検出可能なp-ニトロフェニルアニオン (pNP) の産生はみられません。
    4. RNase活性:本アダプターとFAMラベルしたRNA転写物40 ngを混合し、37℃で16時間インキュベートした場合、ポリアクリルアミド電気泳動によって検出可能なRNase活性はみられません。

    II. USER Enyzme ()

    溶液組成:50 mM KCl、5 mM NaCl、10 mM Tris-HCl (pH 7.4 @ 25°C)、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、175 µg/mL BSA、50% Glycerol

    品質管理アッセイ

    1. 非特異的DNase活性 (16時間):Uracil DNA Glycosylaseを最低50ユニットと、Lambda DNA 1 µgを混合し、NEBuffer 1 50 µL中でインキュベート (37℃、16時間) した場合、アガロースゲル電気泳動で検出可能なヌクレアーゼ活性はみられません。また、Endonuclease VIIIを最低25ユニットと、Lambda-HindIII DNA 1 µgを混合し、Endonuclease VIII反応バッファー50 µL中でインキュベート (37℃、16時間) した場合、アガロースゲル電気泳動で検出可能なヌクレアーゼ活性はみられません。
    2. エキソヌクレアーゼ活性 (放射線の放出):Uracil DNA Glycosylaseを最低50ユニットと、 [3H] ラベルした単鎖および二本鎖E. coli DNAの混合物 1 µgと混合し、NEBuffer 1 50 µL中でインキュベート (37℃、4時間) した場合に放出される放射線は、全放射線の0.1%未満です。また、Endonuclease VIIIを最低10ユニットと、[3H] ラベルした単鎖および二重鎖E. coli DNAの混合物 1 µgを混合し、Endonuclease VIII反応バッファー 50µL中でインキュベート (4℃、37時間) した場合、放出される放射線は、全放射線の0.5%未満です。
    3. エンドヌクレアーゼ活性 (ニッキング):Uracil DNA Glycosylaseを最低50ユニットと、スーパーコイルφX174 DNA 1 µg を混合し、UDG反応バッファー50 µL中でインキュベート (37℃、4時間) した場合、アガロースゲル電気泳動によって検出可能なニック型への変換は 10%未満です。
    4. ホスファターゼ活性:1X 濃度のUSERを最低10 µLと、2.5 mM p-ニトロフェニルリン酸 (pNPP) を混合し、タンパク質ホスファターゼアッセイバッファー (1 MジエタノールアミンpH 9.8、0.5 mM MgCl2) 中でインキュベート (37℃、4時間) した場合、分光測色法 (405 nm) で検出可能なp-ニトロフェニルアニオン (pNP) の産生はみられません。

    III. Index 5 および Index 7 Primers for Illumina® (10 µM) (º)

    品質管理アッセイ

    1. 16時間のインキュベーション:Index [X] Primer for Illumina® 1 μLとHindIII消化したLambda DNA 1 μgを含む反応液50 μLを、37℃で16時間インキュベートした場合、アガロースゲル電気泳動で検出可能な非特異的ヌクレアーゼ分解はみられません。Index [X] Primer for Illumina®とT3 DNA 1 μgを含む反応液50 μLを、37℃で16時間インキュベートした場合も同様に、アガロースゲル電気泳動で検出可能な非特異的ヌクレアーゼ分解はみられません。
    2. エンドヌクレアーゼ活性:Index [X] Primer for Illumina® 1 μLと、φX174 RF IスーパーコイルDNA 1 μgを混合し、37℃で4時間インキュベートした場合 (反応液50 μL)、アガロースゲル電気泳動にで検出されるRF II (ニック分子) への変換は10%未満です。
    3. RNase活性:Index [X] Primer for Illumina®1 μLとRNA転写物40 ngを混合し、37℃で16時間インキュベートした場合 (反応液10 μL)、ゲル電気泳動で検出可能なRNA分解はみられません。
    4. ホスファターゼ活性:Index [X] Primer for Illumina®と2.5 mM p-ニトロフェニルリン酸を混合し、タンパク質ホスファターゼアッセイバッファー (1 M ジエタノールアミンpH 9.8、0.5 mM MgCl2) 中で、37℃、4時間インキュベートした場合、分光測色法 (405 nm) で検出可能なp-ニトロフェニルアニオンの産生はみられません。

    更新:2017年11月

Protocol Id: 1625

Product Description

次世代シーケンシング (NG-seq) はハイスループットな手法であり、これを利用することでクロマチン免疫沈降したサンプルから、標的DNAの特定やその定量をゲノム全体に渡って解析することができます。SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) contains adaptors and primers that are ideally suited for multiplex sample preparation for NG-seq on the Illumina® platform. このキットは、最大96種類の、バーコードを付加した別個のChIP-seq DNAライブラリー調製に使用することができ、これら別個のライブラリーは、まとめて一回のシーケンシング反応で解析することができます。This product provides enough reagents to support up to 96 DNA sequencing libraries, and must be used in combination with SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795.

This product is compatible with SimpleChIP® Enzymatic ChIP Kit (Magnetic Beads) #9003, SimpleChIP® Plus Enzymatic ChIP Kit (Magnetic Beads) #9005, and SimpleChIP® Plus Sonication ChIP kit #56383. This product is not compatible with SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002 and SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004 because agarose beads are blocked with sonicated salmon sperm DNA, which will contaminate DNA library preps and NG-seq.

特異性 / 感度

This kit has been validated in combination with SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 to generate qualified DNA libraries using 50 ng, 5 ng, or 0.5 ng ChIP DNA as starting materials. Libraries prepared from different starting amounts of ChIP DNA exhibit similar Bioanalyzer® profiles, genome mapping rates, numbers of identified binding peak, and signal-to-noise ratios across the whole genome.

バックグラウンド

クロマチン免疫沈降 (ChIP) アッセイは、細胞に自然な状態で存在するクロマチンのタンパク質とDNAとの相互作用を解析するための、強力かつ多機能な手法です (1,2)。This assay can be used to identify multiple proteins associated with a specific region of the genome, or the opposite, to identify the many regions of the genome bound by a particular protein (3-6). It can be used to determine the specific order of recruitment of various proteins to a gene promoter or to "measure" the relative amount of a particular histone modification across an entire gene locus (3,4). In addition to histone proteins, the ChIP assay can be used to analyze binding of transcription factors and co-factors, DNA replication factors and DNA repair proteins. When performing the ChIP assay, cells or tissues are first fixed with formaldehyde, a reversible protein-DNA cross-linking agent that "preserves" the protein-DNA interactions occurring in the cell (1,2). Cells are lysed and chromatin is harvested and fragmented using either sonication or enzymatic digestion. The chromatin is then immunoprecipitated with antibodies specific to a particular protein or histone modification. 目的のタンパク質と結合するDNA配列や、目的のヒストン修飾を受けたDNA配列は、クロスリンクされたクロマチン複合体の一部として共沈降します。すなわち、免疫沈降という選択的なプロセスを経ることで、目的のDNA配列の相対量が濃縮されます。免疫沈降後、タンパク質とDNAを脱クロスリンクし、DNAを精製します。Standard PCR or Quantitative Real-Time PCR can be used to measure the amount of enrichment of a particular DNA sequence by a protein-specific immunoprecipitation (1,2). Alternatively, the ChIP assay can be combined with genomic tiling micro-array (ChIP on chip) techniques, high throughput sequencing, or cloning strategies, all of which allow for genome-wide analysis of protein-DNA interactions and histone modifications (5-8).

  1. Orlando, V. (2000) Trends Biochem Sci 25, 99-104.
  2. Kuo, M.H. and Allis, C.D. (1999) Methods 19, 425-33.
  3. Agalioti, T. et al. (2000) Cell 103, 667-78.
  4. Soutoglou, E. and Talianidis, I. (2002) Science 295, 1901-4.
  5. Mikkelsen, T.S. et al. (2007) Nature 448, 553-60.
  6. Lee, T.I. et al. (2006) Cell 125, 301-13.
  7. Weinmann, A.S. and Farnham, P.J. (2002) Methods 26, 37-47.
  8. Wells, J. and Farnham, P.J. (2002) Methods 26, 48-56.
研究用のみ。診断手順では使用しません。

Cell Signaling Technology is a trademark of Cell Signaling Technology, Inc.
SimpleChIP is a registered trademark of Cell Signaling Technology, Inc.
AMPure is a registered trademark of Beckman Coulter, Inc.
Bioanalyzer is a registered trademark of Agilent Technologies, Inc
IlluminaはIllumina, Incの登録商標です。
Q5 is a registered trademark of New England Biolabs, Inc.
SPRIselect is a registered trademark of Beckman Coulter, Inc.
USER Enzyme is a registered trademark of New England Biolabs, Inc.

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