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51660
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb
一次抗体
モノクローナル抗体

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb #51660

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DNA immunoprecipitations were performed with 1 μg of genomic DNA from mouse embryonic stem cells and either 10 μl of 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb or 10 μl of Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control (DIP Formulated). The enriched DNA was quantified by real-time PCR using mouse Aqp2 exon 1 primers, SimpleDIP™ Mouse Intracisternal-A Particle (IAP) LTR Primers, mouse Lamc3 exon 1 primers, and SimpleChIP® Mouse GAPDH Intron 2 Primers #8986. The amount of immunoprecipitated DNA in each sample is represented as signal relative to the total amount of input DNA, which is equivalent to one.

DDKタグを付加したTET1触媒ドメイン (TET1-CD) をトランスフェクションした293T細胞を、5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb (緑) およびDYKDDDDK Tag Antibody #2368 (赤) を用いて免疫蛍光染色し、共焦点顕微鏡で観察しました。また、DNAをDRAQ5® #4084​で染色して青の疑似カラーで示しました。予想通り、TET1-CD (赤) を発現する293T細胞では、5-メチルシトシン (緑) の量が増加していました。

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb specificity was determined by dot blot. The same sequence of a 387-base pair DNA fragment was generated by PCR using exclusively unmodified cytosine, 5-methylcytosine (5-mC), 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), 5-carboxylcytosine (5-caC), or 5-formylcytosine (5-fC). The respective DNA fragments were blotted onto a nylon membrane, UV cross-linked, and probed with 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb. The upper panel shows the antibody only binding to the DNA fragment containing 5-hmC, while the lower panel shows the membrane stained with methylene blue.

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb specificity was determined by ELISA. The antibody was titrated against a single-stranded DNA oligo containing either unmodified cytosine or differentially modified cytosine (5-mC, 5-hmC, 5-caC, 5-fC). As shown in the graph, the antibody only binds to the oligo containing 5-hmC.

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb specificity was determined by DNA immunoprecipitation. DNA IPs were performed with genomic DNA prepared from mouse embryonic stem cells, spiked with DNA containing either unmethylated cytosine, 5-methylcytosine (5-mC), or 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC). The enriched DNA was quantified by real-time PCR using primers specific to the spiked-in control DNA sequence. The amount of immunoprecipitated DNA in each sample is represented as signal relative to the total amount of input DNA, which is equivalent to one.

To Purchase # 51660S
製品番号 サイズ 価格 在庫
51660S
100 µl

Supporting Data

REACTIVITY All
SENSITIVITY Endogenous
MW (kDa)
Source/Isotype Mouse IgG1

Application Key:

  • W-Western
  • IP-Immunoprecipitation
  • IHC-Immunohistochemistry
  • ChIP-Chromatin Immunoprecipitation
  • IF-Immunofluorescence
  • F-Flow Cytometry
  • E-P-ELISA-Peptide

Species Cross-Reactivity Key:

  • H-Human
  • M-Mouse
  • R-Rat
  • Hm-Hamster
  • Mk-Monkey
  • Mi-Mink
  • C-Chicken
  • Dm-D. melanogaster
  • X-Xenopus
  • Z-Zebrafish
  • B-Bovine
  • Dg-Dog
  • Pg-Pig
  • Sc-S. cerevisiae
  • Ce-C. elegans
  • Hr-Horse
  • All-All Species Expected

製品概要

アプリケーション 希釈率
免疫蛍光染色 (免疫細胞染色) 1:400
DNA Dot Blot 1:1000
Methylated DNA IP 1:50

保存

Supplied in 10 mM sodium HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 100 µg/ml BSA, 50% glycerol and less than 0.02% sodium azide. Store at –20°C. Do not aliquot the antibody.

プロトコール

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免疫蛍光染色 (免疫細胞染色)

A. 溶液および試薬

注意:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水または同等の精製水で調製してください。

ストック溶液

  1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS):(#9808) 1X PBS 1 Lを調製する場合は、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。pHを8.0に調整してください。
  2. エタノール、70%溶液、脱イオン
  3. 1.5 M塩酸
  4. ブロッキングバッファー​ (1X PBS/5%正常血清/0.3% Triton™ X-100):10 mLを用意する場合は、二次抗体の免疫動物と同じ動物種の正常血清0.5 mL (例:Normal Goat Serum (#5425)) と20X PBS 0.5 mLを精製水 (dH2O) 9.0 mLに加えてよく混ぜ合わせてください。スターラーで撹拌しながら、Triton™ X-100 30 µLを加えてください。
  5. 抗体希釈バッファー (1X PBS/1% BSA/0.3% Triton™ X-100):10 mLを調製する場合は、Triton™ X-100 30 µLと20X PBS 0.5 mLを精製水 (dH2O) 9.5 mLに加えてください。混ぜ合わせた後、さらにBSA (#9998) 0.1 gを加えてよく混ぜ合わせてください。
  6. 推奨される蛍光標識抗マウス二次抗体:

  7. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)、Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)

B. 試料作製 - 培養細胞株 (IF-IC)

注意:マルチウェルプレート、チャンバースライドあるいはカバーガラス上で直接細胞を培養、薬剤処理、固定および染色してください。

  1. 培地を吸引し、冷却した70%エタノールで完全に細胞を覆ってください。
  2. 細胞を室温で5分間固定してください。
  3. 固定液を吸引除去し、1X PBSで各5分間、3回すすいでください。
  4. 1.5 M HClを加え、30分間、室温でインキュベートしてください。
  5. HClを吸引し、1X PBSで各5分間、2回すすいでください。
  6. 免疫染色に進んでください (セクションC)。

C. 免疫染色

注意:特に指定がなければこれ以降のインキュベーションは室温で行い、乾燥と蛍光色素の退色防止のため、遮光湿潤箱や蓋付きのディッシュ/プレートを使用してください。

  1. ブロッキングバッファーでサンプルを60分間ブロッキングしてください。
  2. ブロッキングしている間に、データシートの記載に従って一次抗体を抗体希釈バッファーで希釈してください。
  3. ブロッキング液を吸引除去し、希釈した一次抗体を加えてください。
  4. 4℃で一晩インキュベートしてください。
  5. 1X PBSで各5分間、3回すすいでください。
  6. 抗体希釈バッファーで希釈した蛍光標識二次抗体を加え、遮光して室温で1 - 2時間インキュベートしてください。
  7. 1X PBSで各5分間、3回すすいでください。
  8. Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) またはProlong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) などの適切な退色防止剤でサンプルを封入してください。
  9. 最良の結果を得るために、封入剤を室温で一晩硬化させてください。スライドを長期保存する際は、4°C、暗所で、水平にして保存してください。

更新:2015年12月

Protocol Id: 865

DNAドットブロットプロトコール

A. バッファーと試薬

  1. 20X Saline Sodium Citrate (SSC) バッファー: 3.0 M NaCl、0.3M クエン酸ナトリウム、pH7.0​
  2. 10X SSCバッファー:20X SSCバッファーを2倍希釈してください。
  3. 2X DNA変性バッファー:200 mM NaOH、20 mM EDTA
  4. Nuclease-Free Water: (#12931)
  5. ブロッティング膜:本プロトコールは、陽性荷電ナイロン膜を用いて最適化されています
  6. 96-ウェルドットブロット装置
  7. 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST):(#9997) 1X TBST 1 Lを調製する場合は、10X TBST 100mLを精製水 (dH20​) 900 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  8. 脱脂粉乳:(#9999)
  9. ブロッキングバッファー (5% w/v 脱脂粉乳含有1X TBST):150 mLを調製する場合は、脱脂粉乳7.5​ gを1X TBST 150 mLに加え、よく混ぜ合わせてください
  10. Bovine Serum Albumin (BSA): (#9998)
  11. 一次抗体希釈バッファー (5% BSA含有 1X TBST):20 mLを調製する場合は、BSA 1.0 gを1X TBST 20 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  12. ​HRP標識二次抗体:​抗ラビット (#7074)、抗マウス (#7076)
  13. 検出試薬LumiGLO® Reagent and Peroxide (#7003)、または、SignalFire™ ECL Reagent (#6883)

B. ドットブロット

注意:このプロトコールでは、96-ウェルドットブロッティング装置を使用して、断片化、精製されたゲノムDNAを段階希釈 (1000 ng、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng、15.625 ng) し、陽性荷電ナイロン膜に転写する方法を記します。生体サンプルやDNAの種類によっては、抗体で検出するのに適したDNA量の検討が必要な場合があります。Before Starting:
• Purify genomic DNA using a genomic DNA purification protocol or kit and sonicate
genomic DNA to generate fragments between 200 and 500 bp. DNA fragment size
can be analyzed by gel electrophoresis on a 1% agarose gel with a 100 bp DNA
marker.
• 一連のドットブロットを含むサイズにナイロン転写膜を切ってください。• ナイロン転写膜を10X SSCバッファーに浸してください。• 転写膜を96-ウェルドットブロット装置に設置して減圧乾燥してください。

  1. 断片化したゲノムDNAをのnuclease-free waterで100 ng/μLに希釈し、最終容量を100μLにしてください。​2X DNA変性バッファー 100 μLを加え、95°Cで10分間インキュベートしてください (DNAの変性ステップ)。
  2. 20X SSCバッファー 200 μLを加えて速やかに氷上に移し、5分間冷却してください。
  3. nuclease-free water 100 μLを加えてください (DNA濃度20 ng/μL、最終容量を500 μLになります)。
  4. ステップ3のDNA溶液から始めて、DNA溶液250​ μLとnuclease-free water 250 μLに混ぜ合わせることにより、6段階の2倍希釈系列を調製してください。これにより、20 ng/μL、10 ng/μL、5 ng/μL、2.5 ng/μL、1.25 ng/μL、0.625 ng/μL、0.3125 ng/μLの濃度のDNA溶液 250 μLが、7サンプル作成されます。
  5. これらの7つの希釈サンプルそれぞれのうち50 μLを、96-ウェルドットブロット装置の別々のウェルにアプライし、最後のウェルはnuclease-free waterのみアプライしてください。各ウェルに加えられたDNAの量はそれぞれ、1000 ng、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng、15.625 ng、0 ngとなります。穏やかに減圧して、転写膜から溶液を取り除いてください。ステップ6の前にナイロン転写膜から十分に水分を切ってください。
  6. 96-ウェルドットブロット装置からナイロン転写膜を取り出し、ラップに包んでください。
  7. UVを照射 (1200 J/m2) して​ナイロン転写膜をクロスリンクしてください。

C. 転写膜のブロッキングと抗体のインキュベーション

  1. 転写膜をブロッキングバッファー25 mL中でで緩やかに振盪しながら、室温で1時間インキュベートしてください。
  2. 転写膜を1X TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  3. 転写膜を一次抗体反応液10 mL (製品データシートに記載されている推奨希釈率をもとに、一次抗体希釈バッファーで希釈して調製してください) 中で緩やかに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
  4. 1X TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  5. 一次抗体の免疫動物種に対応したHRP標識二次抗体 (Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074またはAnti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076) をブロッキングバッファーで1:2000​希釈して二次抗体反応液10 mLを調製してください。二次抗体反応駅中で転写膜を緩やかに盪しながら、室温で1時間インキュベートしてください。
  6. 転写膜を1X TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  7. 検出操作へ進んでください (セクションD)

D. DNAの検出

  1. LumiGLO® (20X LumiGLO® #7003 0.5 mL、20X Peroxide 0.5 mL、精製水 9.0 mL) 10mL、またはSignalFire™ #6883 (Reagent A 5 mL、Reagent B 5 mL) 10 mL中で転写膜を緩やかに振盪しながら、室温で1分間インキュベートしてください。
  2. 転写膜の余分な液を除去し (この時、乾燥させないようにご注意ください)、ラップで包んでX線フィルムに露光してください。初回10秒間の露光結果により、適度な露光時間が予測できます。

注意:検出反応の反応速度論に基づき、シグナルはインキュベーション直後が最も強く、2時間にかけて減退していきます。

更新:2015年11月

Protocol Id: 804

SimpleDIP Hydroxymethylated DNA IP (hMeDIP) プロトコール

必要な試薬

含まれる試薬

製品番号 製品名
31482 SimpleDIP Cell Lysis Buffer
49291 SimpleDIP DNA IP Buffer (10X)
7009 ChIP Elution Buffer (2X)
74252 TE Buffer
89173 3M Sodium Acetate, pH 5.2
9006 ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads
10007 DNA結合バッファー
10008 DNA Wash Buffer (使用前に4倍量のエタノールを加えてください)
10009 DNA Elution Buffer
10010 DNA Purification Columns
10012 Proteinase K
7013 RNase A
51660 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb
98528 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control (DIP Formulated)
86179 SimpleDIPHydroxymethyl Control Spike-In DNA
20906 SimpleDIPHydroxymethyl Control Primers

含まれない試薬

製品番号 製品名
7017 / 14654 Magnetic Separation Rack
9872 Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2 (Sterile)
12931 Nuclease-free water
- フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール (25:24:1)、10 mM Tris (pH 8.0)、1 mM EDTAで飽和
- クロロホルム/イソアミルアルコール (24:1)
- エタノール (96-100%)
- Trypsin
- Taq DNA polymerase
- dNTP mix
- Real-Time PCR SYBR Green Reaction Mix

セクションI. ゲノムDNAの抽出

実験開始前の準備

  • 各実験につき、5 x 10^6個の細胞を刺激または薬剤処理してください。この細胞数で、DNA約30 μgを調製できます (免疫沈降30回分)。
  • SimpleDIP​ Cell Lysis Bufferを取り出して37℃の水浴で温め、SDSが完全に溶解していることを確認してください。
使用細胞数 およその収量
1 x 10^6 6 µg
5 x 10^6 30 µg
1 x 10^7 60 µg
    1. 浮遊細胞の場合は、細胞数を血球計算盤で計測してください。

    2. 接着細胞の場合は、培地を除去して氷冷した1X PBS10 mLで洗い、液を完全に取り除いてください。トリプシン2 mLを加え、プレートから細胞を剥がしてください。細胞が完全にプレートから剥がれたら、血清を含む細胞培養液8 mLを加えてトリプシンを不活性化し、十分に混ぜ合わせてください。血球計算盤で細胞数を計測してください。

  1. 5 x 10^6個の細胞を15 mLのコニカルチューブに移し、卓上遠心分離機を用いて250​ x g、4°Cで5分間遠心してください。氷冷した1X PBS 10 mLでペレットを2回洗ってください。洗いの度に遠心操作を繰り返してください。
  2. ステップ2で得られた細胞ペレットを、SimpleDIP​Cell Lysis Buffer 500 μLに再懸濁してください。
  3. 細胞とバッファーを1.5 mLの微量遠心分離機用チューブに移してください。Proteinase K 2 μLを加え、55°Cで振盪しながら一晩 (12-18時間) インキュベートしてください。
  4. フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール (25:24:1) 500 μLを加え、30秒間ボルテックスすることで十分に混ぜ合わせてください。
  5. 10,000 x gで5分間遠心分離して、層に分離してください。上部の水層を注意深くとり、新しいチューブへ移してください。
  6. クロロホルム/イソアミルアルコール (24:1) 500 μLを加え、30秒間ボルテックスして十分に混ぜ合わせてください。
  7. 10,000 x gで5分間遠心分離して、層に分離してください。上部の水層を注意深くとり、新しいチューブへ移してください。
  8. 3 M酢酸ナトリウム (pH 5.2) 50 μLを加え、–20°に冷却した100%エタノール1.0 mLを加えてください。-20°Cで一晩または-80°Cで1時間インキュベートし、DNAを沈殿させてください。
  9. 微量遠心分離機で10,000 x g、5分間遠心し、DNAをペレット化させてください。
  10. 上清を注意深く除去し、-20°に冷却した70%エタノールでペレットを洗ってください。上清を捨て、ペレットを風乾または減圧乾燥してください。
  11. ペレットをTEバッファー500​ μLに再懸濁し、RNase A 2 μLを加えて37℃で30分間インキュベートしてください。
  12. ステップ5-11を繰り返した後、ペレットをTEバッファー200 μLに再懸濁してください。

セクションII. ゲノムDNAの断片化と定量

  1. ゲノムDNA (セクションIのステップ13より) に中程度の設定で15秒間のソニケーション処理を5回行ってください。ソニケーション処理を1回する度に、チューブを30秒間氷上で冷却してください。

    • VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator (The VirTis Company, Gardiner, NY) を用いて、マウスES細胞から得られたゲノムDNAの断片化を行った場合、出力を6に設定し (1/8-インチのプローブ)、15秒間のソニケーション処理を5回行うことで、500 bp以下に断片化されました。

    • ソニケーション処理条件の最適化については、Appendix Aを参照してください。

  2. ステップ1.で得られたゲノムDNA 5 μLを、100 bp DNAマーカーとともに1%アガロースゲルで電気泳動し、断片化されたDNAのサイズを確認してください。DNAがおよそ100-500 bpの長さに断片化されていれば、次のステップに進んでください。
  3. DNA濃度を測定するために、ステップ1.で得られたゲノムDNA 2 μLをTEバッファー98 μLに加えて50倍希釈し、OD260を測定してください。原液のDNA濃度 (μg/mL) は、OD260 x 2,500となります。理想的なDNA濃度は50-150 μg/mLです。

セクションIII. DNA免疫沈降

注意:5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAbは、メチル化されたゲノムDNAが一本鎖化されている場合のみに結合します。一方、次世代シーケンサー用ライブラリー調製キットでは、アダプターライゲーションステップで二本鎖DNAが必要となり、hMeDIPのプロトコールによって熱変性したDNAからは効率的にライブラリー調製ができません。このため、NGS解析を行う場合は、アダプターライゲーションのステップをDNA免疫沈降を行う前に、お客様自身で行う必要があります (アダプターライゲーションのプロトコールはメーカーのDNAライブラリー調製プロトコールを参照してください)。この場合、DNAの免疫沈降には、アダプターがライゲーションされたDNA 1 μgを使用してください。

実験開始前の準備

  • 10X SimpleDIPDNA IP Bufferを37℃の水浴で温め、析出物が残っていないことを確認してください。
  1. 1本のチューブへ、免疫沈降を行うサンプル数にあわせて十分なIP mixを調製してください (下の表を参照)。免疫沈降のサンプルにはには、ネガティブコントロールのMouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control (DIP Formulated) #98528と、10% Inputサンプルも必ず含めてください。調製したチューブを氷上に保持してください。
試薬 免疫沈降 (またはInput) 1サンプル当たりの量
10X SimpleDIP DNA IP Buffer 50 µL
ソニケーション処理したゲノムDNA 1 µg
SimpleDIP Hydroxymethyl Control Spike-In DNA (オプション) 1 µL
精製水 (dH2O) 最終容量は最大500 ​μLまで
  1. 希釈したDNAサンプル50 μLを遠心用マイクロチューブに移してください。これが10% Inputサンプルです。
  2. 各免疫沈降用に、IP mix 500 μLを1.5 mLの遠心用マイクロチューブに移し、95°Cで10分間加熱してDNAを変性させてください。10% Inputサンプルも必ず加熱してください。加熱後速やかにサンプルを氷浴に移し、5分間冷却してください。

    • ここから先は、すべてのバッファーを低温に保持し、サンプルは氷上に置いて一本鎖DNAを維持することが重要です。Inputサンプルは、使用するまで–20°Cで保存してください。

  3. 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb #51660 10 μL、またはMouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control (DIP Formulated) #98528 10 μLを実験デザインに従ってIPサンプルに加えてください。ローテーターで攪拌しながら、サンプルを4℃で一晩インキュベートしてください。
  4. ChIP Grade Protein G Magnetic Beads #9006を緩やかにボルテックスし、再懸濁してください。懸濁後速やかにChIP Grade Protein G Magnetic Beads #9006 20 μLを各サンプルに加え、ローテーターで攪拌しながら4℃で2時間インキュベートしてください。セクションIVに進んでください。

セクションIV. 免疫沈降したDNAの洗浄および溶出

  • 実験開始前に用意し、氷冷しておくもの (免疫沈降1回分)
  • 1X SimpleDIP DNA-IP Buffer 4 ​mL (10X SimpleDIPIP Buffer 400 μL+精製水3.6 mL)
  • 2X ChIP Elution Bufferを37℃の水浴で温め、SDSが完全に溶解していることを確認してください。
  • それぞれの免疫沈降につき、1X ChIP Elution Buffer 150 μL (2X ChIP Elution Buffer 75 μL+ 精製水75 μL) を調製し、10% Inputサンプルを用意してください。
  • 水浴またはサーモミキサーを65℃に設定してください。
  1. チューブをMagnetic Separation Rackにセットし、Protein G Magnetic Beads (セクションIIIのステップ5より) を沈澱させてください。溶液が澄むまで1-2分間待ち、上清を注意深く取り除いてください。
  2. 1X SimpleDIP DNA-IP Buffer 1 mLをビーズに加え、ローテーターで撹拌しながら4℃で5分間インキュベートしてください。
  3. チューブをMagnetic Separation Rackにセットし、Protein G Magnetic Beadsを沈澱させてください。溶液が澄むまで1-2分間待ち、上清を注意深く取り除いてください。
  4. ステップ2.と3.を更に3回繰り返し、合計4回洗ってください。
  5. 1X ChIP Elution Buffer 150 μLを、各免疫沈降サンプルと10% Inputサンプルに加えてください。Inputサンプルはステップ9で使用するまで室温に置いてください。
  6. 緩やかにボルテックス (1,200 rpm) しながら、65℃で30分間、抗体/Protein G BeadsからDNAを溶出してください。本ステップには、サーモミキサーの使用をお勧めします。代わりにローテーターを用いて室温で溶出することもできますが、完全に溶出できない可能性があります。
  7. チューブをMagnetic Separation Rackにセットし、液が澄むまで1-2分間待ち、Protein G Magnetic Beadsを分離させてください。
  8. 溶出したDNAを新しいチューブに注意深く移してください。
  9. 直ちにセクションVに進むか、もしくは、サンプルを‐20℃で保存してください。ただし、沈殿物の形成を防ぐために、DNA Binding Bufferを加える前に (セクションVのステップ1)、必ずサンプルを室温に戻してください。

セクションV. スピンカラムを用いたDNAの精製

実験開始前の準備

  • 使用前に、DNA Wash Bufferにエタノール (96-100%) 10 mLを加えてください。このステップは、DNA精製の最初のセットの前に、1回だけ実施してください。
  • セクションIVで得られた各DNAサンプルに対し、DNAスピンカラムとコレクションチューブを一つずつ用意してください。
  1. DNA Binding Buffer 750 μLを各DNAサンプルに加え、軽くボルテックスしてください。

    • サンプルに対して5倍量のDNA Binding Bufferを使用します。

  2. ステップ1の各サンプル450 μLを、コレクションチューブにセットしたDNA精製カラムに移してください。
  3. 18,500​ x gで30秒間遠心分離してください。
  4. コレクションチューブからスピンカラムを取り外し、液体を廃棄してください。スピンカラムをコレクションチューブに再セットしてください。
  5. ステップ1の残りの各サンプル450 μLをコレクションチューブにセットしたスピンカラムに移し、ステップ3と4を繰り返してください。
  6. DNA Wash Buffer 750 μLを、コレクションチューブにセットしたスピンカラムに加えてください。
  7. 18,500​ x gで30秒間遠心分離してください。
  8. コレクションチューブからDNAスピンカラムを取り外し、液体を捨ててください。スピンカラムをコレクションチューブに再セットしてください。
  9. 18,500​ x gで30秒間遠心分離してください。
  10. コレクションチューブと液体を廃棄してください。スピンカラムは廃棄しないでください。
  11. DNA Elution Buffer 50 μLを各スピンカラムに加え、新しい1.5 mLの遠心分離用チューブにセットしてください。
  12. 18,500​ x gで30秒間遠心分離して、DNAを溶出してください。
  13. DNAスピンカラムを取り外し、廃棄してください。得られた溶出液が精製されたDNAです。サンプルは-20℃で保存することができます。

セクションVI. PCRによるDNAの定量

推奨される対処法

  • コンタミネーションの危険性を最小化するために、フィルター付チップを使用してください。
  • キットに含まれているコントロールプライマーはSimpleDIPHydroxymethyl Control Spike-In DNA #86179に特異的であり、通常のPCR、定量リアルタイムPCRのどちらでも使用できます。
  • 非特異的なPCR産物の形成を最小化するために、ホットスタートTaqポリメラーゼの使用を推奨します。
  • プライマーの設定は非常に重要です。以下の条件に近いプライマーを設計してください:
プライマーの長さ 24塩基
最適Tm 60°C
最適GC 50%
アンプリコンのサイズ 150-200 bp (通常のPCR)、80-160 bp (リアルタイム定量PCR)

通常のPCR:

  1. 0.2 mLのPCRチューブに適切な番号をラベルしてください。10% Inputサンプル、ネガティブコントロール用Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control (DIP Formulated) #98528、DNAを含まないサンプル (DNAコンタミネーション確認用) のチューブも用意してください。
  2. 各チューブにDNAサンプル2 μLを分注してください。
  3. 分量不足を防ぐために、実際のチューブの本数に2本追加した量を全体量として、マスターミックスを下記の通りに調製してください。各反応用チューブにマスターミックス18 μLを加えてください。
試薬 PCR反応1回分の分量 (18 μL)
Nuclease-free dH2O 12.5 µL
10x PCR Buffer 2.0 µL
4 mM dNTP Mix 1.0 µL
5 µMのプライマー 2.0 µL
Taq DNA Polymerase 0.5 µL
  1. PCR反応を以下のプログラムで開始してください:
a. 初期変性 95℃ 5分間
b. 変性 95℃ 30 秒間
c. アニーリング 62℃ 30 秒間
d. 伸長反応 72℃ 30 秒間
e. ステップb-dを繰り返し、計34サイクル反応させてください。
f. 最終伸長反応 72℃ 5分間
  1. 反応終了後、100 bpのDNAマーカーとともに、各PCR産物10 μLを2%アガロースゲルまたは10%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動してください。Positive control spike-in #20906に特異的なPCR産物のサイズは120 bpです。

定量的リアルタイムPCR:

  1. 使用するPCR装置のモデルに対応するPCRチューブあるいはPCRプレートにラベルしてください。PCR反応には、ネガティブコントロール用Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control (DIP Formulated) #98528、DNAを含まないチューブまたはウェル (DNAのコンタミネーション確認用) を用意してください。標準曲線作成と増幅効率の確認のため、10% InputゲノムDNAの段階希釈サンプル (希釈なし、1:5、1:25、1:125) も用意してください。
  2. PCRチューブあるいはPCRプレートのウェルに、適切なDNAサンプル2 μLを加えてください。
  3. 以下のように、マスターミックスを調製してください。分量不足を考慮して、実際のチューブの本数に2本追加した量を全体量として、調製してください。各PCRチューブあるいは各ウェルにマスターミックス18 μLを加えてください。
試薬 PCR反応1回分の分量 (18 μL)
Nuclease-free H2O 6 µL
5 µM primers 2 µL
SYBR Green Reaction Mix 10 µL
  1. 以下のプログラムでPCRを開始してください:
a. 初期変性 95℃ 3分間
b. 変性 95℃ 15 秒間
c. アニーリング 65℃ 60 秒間
d. ステップb-cを繰り返し、計40サイクル反応させてください
  1. リアルタイムPCR装置に付属のソフトウェアを使用して、定量結果を解析してください。あるいは、Percent Input法により下記の公式を用いて、免疫沈降の効率を算出することもできます。この方法では、免疫沈降により回収された各シグナルは、インプットクロマチンの総量のパーセントとして表されます。

    Percent Input = 10% x 2(C[T] 10%Input Sample - C[T] IP Sample)
    C[T] = CT = PCR反応の閾値となるサイクル

Appendix A. ソニケーション処理条件の最適化

ゲノムDNAを150-500 bpの長さに断片化する場合の最適条件は、細胞の種類と数、使用するソニケーターの種類によって異なります。下記は、特定の細胞の種類や細胞密度におけるソニケーション処理の最適条件を決定するためのプロトコールです。

  1. セクションIのステップ1-13に従い、5 x 10^6個の細胞を用いてゲノムDNAを調製してください。
  2. 中程度の設定でそれぞれ15秒間のソニケーション処理を10回行ってください。ソニケーション処理を1回する度にチューブを30秒間氷上で冷却してください。ソニケーション処理を2回するごとに、DNA溶液を5 μLずつ分取してください。100bp DNAマーカーとともに1%アガロースゲルで電気泳動し、DNA断片のサイズを測定してください。
  3. 150-500 bpのDNA断片が得られたソニケーション処理の条件を確認してください。ここで確認された条件は、本実験のプロトコールのセクションIIのステップ1で使用できます。
5 x 10^6個のマウスES細胞から抽出したゲノムDNA

VirTis Virsonic 100Ultrasonic Homogenizer/Sonicatorを6に設定し (1/8-インチのプローブ)、15秒間の超音波処理を0、2、4、6、8および10回それぞれ行うことで、5 x 10^6個のマウスES細胞から抽出したゲノムDNAを断片化しました。DNAサンプルを100 bpラダーとともに1%アガロースゲルで電気泳動して分離し、臭化エチジウムで染色しました。

Appendix B. トラブルシューティングガイド

プロトコールのステップ 問題 原因と対応策
プロトコールのステップ 問題 原因と対応策
ゲノムDNAの抽出 断片化されたDNAの濃度が極めて低い。 ゲノムDNAの抽出に、十分な細胞数が使われていません。ゲノムDNAの抽出を行う前に、細胞数計測用に別途用意した細胞プレートで、正確な細胞数を測定してください。SimpleDIP Cell Lysis Buffer 500 μLにつき1 x 10^7個の細胞まで溶解できます。1 x 10^7個以上の細胞を加えると、細胞溶解が阻害され、DNA濃度が低下する可能性があります。
ゲノムDNAの断片化と定量 OD260/280比が1.8未満 (DNAの純度が低い)。 フェノール/クロロホルム抽出中にフェノールや塩の持ち込みによるコンタミネーションが起こっている可能性があります。抽出過程において、フェノールまたは塩が誤ってDNAを含む上清に混入するのを防ぐため、上層を少量残してください。
DNA断片のサイズが不適切。 ソニケーション処理の強さまたは回数が適切でない可能性があります。Appendix AのDNA断片化条件の最適化プロトコールを参照ください。
DNA免疫沈降 免疫沈降において抗体またはDNAの量を変更できるか。 本キットは1 μgの抗体と1 μgのゲノムDNAを用いて最適化されています。これより少ない抗体またはDNAを用いると、ヒドロキシメチル化DNAの回収量が減る可能性があります。また、これより多い抗体またはDNAを用いると、免疫沈降の特異性が低下し、擬陽性のシグナルを得る可能性があります。
他の抗体をこのキットで使用することは可能か。 本キットのプロトコールは、キットに含まれる抗体で検証され、最適化されています。他の抗体では、本プロトコールで最適な性能を発揮できない可能性があります。
PCRによるDNAの定量 ヒドロキシメチル化DNAのシグナルが得られない、または非常に僅かである。 免疫沈降1回当たり、抗体1 μgおよびゲノムDNA 1μgを使用してください。それより少ない抗体またはDNAを用いると、ヒドロキシメチル化DNAの回収量が減り、シグナルが弱まる可能性があります。
抗体は一本鎖DNAのみに結合します。再アニーリングを防ぐため、変性後のプロトコールの全ステップは、必ず氷上で行ってください。
ビーズからのDNA溶出が不完全な場合、ヒドロキシメチル化DNAの回収量が減り、シグナルが弱まる可能性があります。ビーズの懸濁状態を保つよう頻繁に撹拌しながら、65℃でProtein G BeadsからDNAを溶出してください。
IgGコントロールの免疫沈降でバックグラウンドが高い。 免疫沈降1回当たり、抗体1 μgおよびゲノムDNA 1μgを使用してください。それより多い抗体またはDNAを用いると、非特異的な相互作用が増え、バックグラウンドが高くなる可能性があります。それより少ないDNAを用いると、Inputに対してコントロールIgGの免疫沈降のPCRで得られるシグナルが相対的に高くなる可能性があります。
通常のPCRとゲル電気泳動によって解析を行う場合は、プラトーに達する前にPCR産物を解析するため、PCRサイクル数を減らしてください。対数増幅中のサイクルで測定しない場合は、増幅前のDNA量の差が正確に測定できません。あるいは、リアルタイムPCRを用いて免疫沈降物を定量してください。
DIPシーケンス このキットはシーケンシングにも使用可能か。 対応しています。ただし、次世代シーケンス用ライブラリー調製キットでは、アダプターライゲーションのステップに二本鎖DNAが必要です。MeDIPプロトコールで得られる熱変性したDNAでは効率的にライブラリーが調製できません。このため、NGS解析を行う場合は、アダプターライゲーションのステップをDNA免疫沈降を行う前に、お客様自身で行う必要があります (アダプターライゲーションのプロトコールはメーカーのDNAライブラリー調製プロトコールを参照してください)。この場合、DNAの免疫沈降には、アダプターがライゲーションされたDNA 1 μgを使用してください。
保存 プロトコール終了までの過程で、どの時点でプロトコールを停止し、サンプルを保存できるか。 細胞ペレットは、セクションIのステップ2の終了後、瞬間凍結して–80℃で保存できます。
ゲノムDNAは、セクションIのステップ9またはステップ13終了後、–20℃で保存できます。
断片化したDNAは、セクションIIのステップ3終了後、–20℃で保存できます。
DNA免疫沈降サンプルは、セクションIVのステップ9終了後、–20℃で一晩保存できます。ただし、沈降物の生成を防ぐために、DNA Binding Reagent Aを加える (セクションVのステップ1) 前に、必ずサンプルを室温に戻してください。
免疫沈降したゲノムDNAは、セクションVのステップ13終了後、–20°Cで保存できます。ただし、PCRで使用する前に、凍結した試料を必ず37°Cで10分間加熱してください。保存中にチューブに結合したDNAを、熱処理によって遊離させることができます。

更新:2015年11月

Protocol Id: 844

特異性 / 感度

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb recognizes endogenous levels of 5-hmC; however many cells and tissues contain very low levels of 5-hmC that may fall below the detection limits of this antibody. This antibody has been validated using ELISA, dot blot, and MeDIP assays and shows high specificity for 5-hmC.

Species Reactivity:

All Species Expected

使用抗原 / 精製方法

Monoclonal antibody is produced by immunizing animals with 5-hydroxymethylcytidine.

バックグラウンド

Methylation of DNA at cytosine residues is a heritable, epigenetic modification that is critical for proper regulation of gene expression, genomic imprinting, and mammalian development (1,2). 5-methylcytosine is a repressive epigenetic mark established de novo by two enzymes, DNMT3a and DNMT3b, and is maintained by DNMT1 (3, 4). 5-methylcytosine was originally thought to be passively depleted during DNA replication. However, subsequent studies have shown that Ten-Eleven Translocation (TET) proteins TET1, TET2, and TET3 can catalyze the oxidation of methylated cytosine to 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) (5). Additionally, TET proteins can further oxidize 5-hmC to form 5-formylcytosine (5-fC) and 5-carboxylcytosine (5-caC), both of which are excised by thymine-DNA glycosylase (TDG), effectively linking cytosine oxidation to the base excision repair pathway and supporting active cytosine demethylation (6,7).

TET protein-mediated cytosine hydroxymethylation was initially demonstrated in mouse brain and embryonic stem cells (5, 8). Since then this modification has been discovered in many tissues, with the highest levels found in the brain (9). While 5-fC and 5-caC appear to be short-lived intermediate species, there is mounting evidence showing that 5-hmC is a distinct epigenetic mark with various unique functions (10,11). The modified base itself is stable in vivo and interacts with various readers including MeCP2 (11,12). The global level of 5-hmC increases during brain development and 5-hmC is enriched at promoter regions and poised enhancers. Furthermore, there is an inverse correlation between levels of 5-hmC and histone H3K9 and H3K27 trimethylation, suggesting a role for 5-hmC in gene activation (12). Lower amounts of 5-hmC have been reported in various cancers including myeloid leukemia and melanoma (13,14).

  1. Hermann, A. et al. (2004) Cell Mol Life Sci 61, 2571-87.
  2. Turek-Plewa, J. and Jagodziński, P.P. (2005) Cell Mol Biol Lett 10, 631-47.
  3. Okano, M. et al. (1999) Cell 99, 247-57.
  4. Li, E. et al. (1992) Cell 69, 915-26.
  5. Tahiliani, M. et al. (2009) Science 324, 930-5.
  6. He, Y.F. et al. (2011) Science 333, 1303-7.
  7. Ito, S. et al. (2011) Science 333, 1300-3.
  8. Kriaucionis, S. and Heintz, N. (2009) Science 324, 929-30.
  9. Globisch, D. et al. (2010) PLoS One 5, e15367.
  10. Gao, Y. et al. (2013) Cell Stem Cell 12, 453-69.
  11. Mellén, M. et al. (2012) Cell 151, 1417-30.
  12. Wen, L. et al. (2014) Genome Biol 15, R49.
  13. Delhommeau, F. et al. (2009) N Engl J Med 360, 2289-301.
  14. Lian, C.G. et al. (2012) Cell 150, 1135-46.
研究用のみ。診断手順では使用しません。

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