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15145
α-Actinin 4 (D7U5A) Rabbit mAb 
一次抗体
モノクローナル抗体

α-Actinin 4 (D7U5A) Rabbit mAb  #15145

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  1. WB
  2. IHC

Western blot analysis of extracts from various cell lines using α-Actinin 4 (D7U5A) Rabbit mAb.

Western blot analysis of extracts from 293T cells, mock transfected (-) or transfected with constructs expressing Myc/DDK-tagged full-length human α-actinin proteins (+), using α-Actinin 4 (D7U5A) Rabbit mAb (upper) and Myc-Tag (71D10) Rabbit mAb #2278 (lower).

Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded A549 cell pellet (left, high-expressing) or MOLT-4 cell pellet (right, low-expressing) using using α-Actinin 4 (D7U5A) Rabbit mAb.

Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded human serous papillary carcinoma of the ovary using α-Actinin 4 (D7U5A) Rabbit mAb (left) compared to concentration matched Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 (right).

Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded human skin (left) or skeletal muscle (right) using using α-Actinin 4 (D7U5A) Rabbit mAb. Note the lack of staining in skeletal myocytes.

Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded mouse small intestine using α-Actinin 4 (D7U5A) Rabbit mAb.

To Purchase # 15145S
製品番号 サイズ 価格 在庫
15145S
100 µl

Supporting Data

REACTIVITY H M R
SENSITIVITY Endogenous
MW (kDa) 100
Source/Isotype Rabbit IgG

Application Key:

  • W-Western
  • IP-Immunoprecipitation
  • IHC-Immunohistochemistry
  • ChIP-Chromatin Immunoprecipitation
  • IF-Immunofluorescence
  • F-Flow Cytometry
  • E-P-ELISA-Peptide

Species Cross-Reactivity Key:

  • H-Human
  • M-Mouse
  • R-Rat
  • Hm-Hamster
  • Mk-Monkey
  • Mi-Mink
  • C-Chicken
  • Dm-D. melanogaster
  • X-Xenopus
  • Z-Zebrafish
  • B-Bovine
  • Dg-Dog
  • Pg-Pig
  • Sc-S. cerevisiae
  • Ce-C. elegans
  • Hr-Horse
  • All-All Species Expected

製品概要

アプリケーション 希釈率
ウェスタンブロッティング 1:1000
免疫組織化学染色プロトコール (パラフィン切片) 1:200

保存

Supplied in 10 mM sodium HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 100 µg/ml BSA, 50% glycerol and less than 0.02% sodium azide. Store at –20°C. Do not aliquot the antibody.

プロトコール

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ウェスタンブロッティング (WB) プロトコール

ウェスタンブロットでは、転写膜と希釈した一次抗体を静かに振盪しながら、4℃で一晩反応させてください。一次抗体の希釈液として、5% (w/v)の脱脂粉乳および0.1% Tween®20​を含む1X TBSを使用します。

注意:抗体の推奨希釈率については、各製品のデータシートまたはウェブの製品ページを参照してください。

A. 溶液および試薬

注意​:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS) (#9808):1X PBSを1 L調製する場合は、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  2. 10X Tris Buffered Saline (TBS) (#12498):1X TBSを1 L調製する場合は、10X TBS 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  3. 1X SDSサンプルバッファー (Blue Loading Pack (#7722) またはRed Loading Pack (#7723)):3X SDSローディングバッファーに、1/10量の30X DTTを加え、新しい3X 還元用ローディングバッファーを調製してください。精製水 (dH2O) で1X に希釈してください。
  4. 10X Tris-Glycine SDS Running Buffer (#4050):1X Running Bufferを1 L調製する場合、10X Running Buffer 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  5. 10X Tris-Glycine Transfer Buffer (#12539):1X Transfer Bufferを1 L調製する場合、10X Transfer Buffer 100 mLをメタノール200 mL + 精製水 (dH2O) 700 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  6. 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)​ (#9997):1X TBST を1 L調製する場合、10X TBST 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  7. Nonfat Dry Milk (脱脂粉乳) (#9999)
  8. ブロッキングバッファー:5% w/v 脱脂粉乳含有1X TBST;150 mlLを調製する場合は、脱脂粉乳7.5 gを1X TBST 150 mLに加えてよく混ぜ合わせ、完全に溶解してください。
  9. 洗浄バッファー:1X TBST;10xTBST (#9997) を精製水で10倍希釈してください (上記6をご参照ください)。
  10. 一次抗体希釈バッファー:5%脱脂粉乳含有1X TBST;20 mL調製する場合は、脱脂粉乳1.0 gを1X TBST 20 mLに加えてよく混ぜ合わせ、完全に溶解してください。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack (#7727)
  12. ​Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa) (#13953)
  13. 転写膜 (#12369):このプロトコールはニトロセルロース膜を用いて最適化されています。ポアサイズは0.2 µmをお勧めしています。
  14. HRP標識二次抗体:Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074)
  15. 検出試薬:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)

B. タンパク質のブロッティング

最も汎用的なサンプル調製プロトコール

  1. 目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 培養ディッシュから培地を吸引除去し、細胞を1X PBSで洗った後、再度吸引除去してください。
  3. 1X SDSサンプルバッファーを加え (6ウェルプレートは100 µL/ウェル、直径10 cmプレートは500 µL/プレート)、細胞を溶解してください。直ちにプレートから細胞を掻き取り、抽出物を遠心分離チューブに移してください。氷上に保持してください。
  4. 10-15秒間超音波処理してください。この処理には、細胞を完全に溶解する目的と、DNAを剪断してサンプルの粘性を下げる目的があります。
  5. サンプル20 µLを95-100℃で5分間加熱処理後、氷上で冷却してください。
  6. 5分間遠心分離してください。
  7. SDS-PAGEゲル (10 cm × 10 cm) に20 µLをアプライし、電気泳動してください。

    注意:転写確認用のPrestained Protein Marker (#13953、10 µl/lane) および分子量確認用のBiotinylated Protein Ladder (#7727、10 µL/lane) も同時に電気泳動することをお勧めしています。

  8. ニトロセルロース膜 (#12369) に転写してください。

C. 転写膜のブロッキングと抗体反応

注意:10 cm x 10 cm (100 cm2) の転写膜用の容量を記載しています。サイズの異なる転写膜をご使用の際は、適宜容量を調節してください。

I. 転写膜のブロッキング

  1. オプション:転写後、転写膜を室温で5分間、TBS 25 mLで洗ってください。
  2. 転写膜を室温で1時間、ブロッキングバッファー25 mL中でインキュベートしてください。
  3. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。

II. 一次抗体反応

  1. 一次抗体液10 mL (製品のデータシートに記載されている希釈バッファー、希釈率をもとに適切に調製してください) 中で転写膜を静かに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  3. ビオチン化プロテインマーカーを検出するため、Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074、2000倍希釈) およびAnti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075、1000–3000倍希釈) を含むブロッキングバッファー10 mL中で転写膜を静かに振盪しながら、室温で1時間インキュベートしてください。
  4. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  5. 検出操作へ進んでください (セクションD)。

D. タンパク質の検出

使用法:

  1. 転写膜に結合したHRP (抗体標識) を、TBSTで5分間、3回洗ってください。
  2. 2X Reagent Aと2X Reagent Bを等量ずつ混ぜ合わせ、1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883) を調製してください。例えば、10 mLを調製する場合は、Reagent A 5 mLをReagent B 5 mLに加えてください)。よく混ぜ合わせてください。
  3. 基質を転写膜を1分間インキュベートし、過剰な溶液を取り除き (転写膜を乾燥させないようにご注意ください) 、ラップで覆ってX線フィルムで露光してください。

* 肌に対して繰り返し露光することは避けてください。

更新:2005年6月

改訂日:2013年11月

ウェスタンブロットリプロービングプロトコール

既存の膜のリプロービングは、サンプル量が限られている場合、複数のタンパク質を独立してイムノブロットする便利な手法です。最高の結果を得るためには、リプロービングは避け、常に新しくブロッティングを行うことを推奨します。リプロービングは価値ある方法ですが、ブロットをリプロービングするごとに、バックグランドシグナルが増す可能性があります。また、リプロービング前にまず抗体複合体が除去されていることを確認し、新しい抗体の結合によるシグナルが、最初の免疫沈降実験の残りのシグナルではないことを確認してください。これは、このブロットをECL試薬で再露光し、次の一次抗体を追加する前にシグナルがないことを確かめることで、確認できます。

A. 溶液および試薬

注意:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水または同等の精製水で調製してください。

  1. ​洗浄バッファー:​Tris Buffered Saline with Tween® 20; 10X TBST (#9997) を精製水で10倍希釈してください。
  2. ストリッピングバッファー:100 mLを調製する場合は、1M Tris-HCl (pH 6.8​) 6.25 mL、20% SDS 10 mL、βメルカプトエタノール700 μLを混ぜ合わせてください。精製水 (dH20) で100 mLにしてください。使用直前に新しいバッファーを調製してください。

B. プロトコール

  1. フィルム露光後、転写膜をTBSTで各5分間、4回洗ってください。最良の結果を得るために、転写膜は乾かさないようにしてください。
  2. 転写膜をストリッピングバッファー中で緩やかに振盪しながら、50°Cで30分間インキュベートしてください。
  3. 転写膜をTBSTで各5分間、6回洗ってください。
  4. オプション:最初のシグナルを確実に除去するために、転写膜をTBST 10 mLで5分間、2回洗ってください。転写膜をLumiGLO®で穏やかに振盪しながら、室温で1分間インキュベートしてください。転写膜の過剰な液を除去してください。乾かさないでください。ラップで包んで、X線フィルムに露光してください。
  5. 再度転写膜をTBSTで各5分間、4回洗ってください。
  6. 転写膜の再利用の準備が整いました。ウェスタンブロッティングプロトコールの「I. 転写膜のブロッキング」と「II.抗体のインキュベーション」の手順に従って、検出を開始してください。

更新:2005年6月

改訂日:2016年6月

Protocol Id: 263

免疫組織化学染色プロトコール (パラフィン切片)

A. 溶液および試薬

注意​:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. キシレン
  2. エタノール、無水変性、病理学グレード (100%および95%)
  3. 脱イオン水 (dH2O)
  4. ヘマトキシリン (オプション)
  5. 洗浄バッファー
    1. 1X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)​:1X TBST 1 Lを調製する場合は、10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (#9997) 100 mLを精製水 (dH20)​ 900 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  6. SignalStain® Antibody Diluent (#8112)
  7. 1X クエン酸賦活化液:250 mLを調製する場合は、SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 25 mLを精製水 (dH2O) 225 mLで希釈してください。
  8. 3%過酸化水素水​:100 mLを調製する場合は、30%過酸化水素水 (H2O2) 10 mLを精製水 (dH2O) 90 mLに加えてください。
  9. ブロッキング液​:5%正常ヤギ血清/TBSTまたは1X Animal-Free Blocking Solution
    1. TBST/5%正常ヤギ血清:Normal Goat Serum (#5425) 250 µLを1X TBST 5 mLに加えてください。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution:Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019) 1 mLを精製水 (dH2O) 4 mLに加えてください。
  10. 検出システム​:SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Rabbit #8114)
  11. ​発色基質​:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)
  12. ヘマトキシリン:Hematoxylin (#14166)
  13. ​封入剤:SignalStain® Mounting Medium (#14177)

B. 脱パラフィン/再水和

注意:操作の間は、常にスライドを乾かさないようにしてください。

  1. 切片の脱パラフィン/水和:
    1. キシレンで切片を各5分間、3回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
    3. 95%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
  2. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、2回洗ってください。

C. 抗原賦活化

クエン酸バッファーの場合:切片を1X クエン酸賦活化液に浸漬した状態で、沸騰し始めるまで電子レンジで加熱し、沸騰直前の温度 (95°-98°C) を10分間維持してください。スライドを実験台で30分間冷却してください。

D. 染色

  1. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、3回洗ってください。
  2. 3%過酸化水素で切片を10分間インキュベートしてください。
  3. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、2回洗ってください。
  4. 洗浄バッファーで切片を5分間洗ってください。
  5. ブロッキング液100​-400 μLで各切片を室温で1時間ブロッキングしてください。
  6. ブロッキング液を除去し、SignalStain®​ Antibody Diluent (#8112) で希釈した一次抗体100-400 μLを各切片に加えてください。4℃で一晩インキュベートしてください。
  7. SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114​) を室温に戻してください。
  8. 抗体液を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください。
  9. 1-3滴のSignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114) で切片を覆ってください。加湿チャンバー内 (室温) で30分間インキュベートしてください。
  10. 洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください。
  11. 使用前にSignalStain® DAB Chromogen Concentrate 1滴 (30 µL) をSignalStain® DAB Diluent 1 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  12. 調製したSignalStain® DAB溶液 100-400 µLを各切片に加え、注意深く観察してください。通常は1-10分で十分な染色強度が得られます。
  13. スライドを精製水 (dH2O) に浸してください。
  14. 必要に応じて、Hematoxylin (#14166) で切片を対比染色してください。
  15. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、2回洗ってください。
  16. 切片を脱水してください:
    1. 95%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    3. キシレンで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
  17. カバーガラスとMounting Medium (#14177) で切片を封入してください。

検出試薬と基質の互換性
RECOMMENDED
DETECTION REAGENTS
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) #18653
COMPATIBLE
CHROMOGEN
SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632  

注意:このプロトコールで指定されているもの以外の検出試薬を使用する場合は、その検出試薬の感度が異なることを考慮して、一次抗体をさらに最適化する必要があります。


更新:2010年2月

改訂日:2020年4月

Protocol Id: 283

特異性 / 感度

α-Actinin 4 (D7U5A) Rabbit mAb recognizes endogenous levels of total α-actinin 4 protein. This antibody does not cross-react with other α-actinin proteins.

Species Reactivity:

ヒト, マウス, Rat

使用抗原 / 精製方法

Monoclonal antibody is produced by immunizing animals with a synthetic peptide corresponding to residues surrounding Ala6 of human α-actinin 4 protein.

バックグラウンド

α-Actinin belongs to the spectrin family of cytoskeletal proteins. It was first recognized as an actin cross-linking protein, forming an antiparallel homodimer with an actin binding head at the amino terminus of each monomer. The α-actinin protein interacts with a large number of proteins involved in signaling to the cytoskeleton, including those involved in cellular adhesion, migration, and immune cell targeting (1). The interaction of α-actinin with intercellular adhesion molecule-5 (ICAM-5) helps to promote neurite outgrowth (2). In osteoblasts, interaction of α-actinin with integrins stabilizes focal adhesions and may protect cells from apoptosis (3). The cytoskeletal α-actinin isoforms 1 and 4 (ACTN1, ACTN4) are non-muscle proteins that are present in stress fibers, sites of adhesion and intercellular contacts, filopodia, and lamellipodia. The muscle isoforms 2 and 3 (ACTN2, ACTN3) localize to the Z-discs of striated muscle and to dense bodies and plaques in smooth muscle (1).

The ubiquitously expressed α-actinin 4 (ACTN4) protein typically localizes to the cytoskeleton but extracellular stimuli will prompt nuclear translocation in some cells (4). Research studies suggest that ACTN4 can mediate cell signaling and regulate gene expression as a transcriptional coactivator (5,6). Increased expression of ACTN4 protein and amplification of the ACTN4 gene are seen in many cancers and correlates with poor prognosis and metastasis (7). Mutations in the corresponding ACTN4 gene are responsible for focal segmental glomerulosclerosis (FSGS1), a severe renal disorder characterized by reduced kidney function, proteinuria, and progressive kidney failure (8).

  1. Otey, C.A. and Carpen, O. (2004) Cell Motil Cytoskeleton 58, 104-11.
  2. Nyman-Huttunen, H. et al. (2006) J Cell Sci 119, 3057-66.
  3. Triplett, J.W. and Pavalko, F.M. (2006) Am J Physiol Cell Physiol 291, C909-21.
  4. Honda, K. et al. (1998) J Cell Biol 140, 1383-93.
  5. Aksenova, V. et al. (2013) Oncotarget 4, 362-72.
  6. Khurana, S. et al. (2011) J Biol Chem 286, 1850-9.
  7. Watabe, Y. et al. (2014) Cancer Med 3, 613-22.
  8. Kaplan, J.M. et al. (2000) Nat Genet 24, 251-6.

Pathways & Proteins

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