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6707
AMPKα (23A3) Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate)
WB & IP関連製品
モノクローナル抗体

AMPKα (23A3) Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate) #6707

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  1. IP

Immunoprecipitation of 293 and C6 cell lysates using Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Sepharose® Bead Conjugate) #3423 and AMPKα (23A3) Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate). The western blot was probed using AMPKα (F6) Mouse mAb #2793.

To Purchase # 6707S
製品番号 サイズ 価格 在庫
6707S
400 µl

Supporting Data

REACTIVITY H M R Mk
SENSITIVITY Endogenous
MW (kDa) 62
Source/Isotype Rabbit IgG

Application Key:

  • W-Western
  • IP-Immunoprecipitation
  • IHC-Immunohistochemistry
  • ChIP-Chromatin Immunoprecipitation
  • IF-Immunofluorescence
  • F-Flow Cytometry
  • E-P-ELISA-Peptide

Species Cross-Reactivity Key:

  • H-Human
  • M-Mouse
  • R-Rat
  • Hm-Hamster
  • Mk-Monkey
  • Mi-Mink
  • C-Chicken
  • Dm-D. melanogaster
  • X-Xenopus
  • Z-Zebrafish
  • B-Bovine
  • Dg-Dog
  • Pg-Pig
  • Sc-S. cerevisiae
  • Ce-C. elegans
  • Hr-Horse
  • All-All Species Expected

Product Description

This Cell Signaling Technology antibody is immobilized via covalent binding of primary amino groups to N-hydroxysuccinimide (NHS)-activated Sepharose® beads. AMPKα (23A3) Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate) is useful for immunoprecipitation assays. The antibody is expected to exhibit the same species cross-reactivity as the unconjugated AMPKα (23A3) Rabbit mAb #2603.

製品概要

アプリケーション 希釈率
免疫沈降 1:20

保存

Supplied in 10 mM sodium HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 100 µg/ml BSA, 50% glycerol. Store at –20°C. Do not aliquot the antibodies.

プロトコール

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ウェスタンブロッティング解析のための免疫沈降

このプロトコールは、未変性タンパク質を免疫沈降し、ウェスタンブロッティングやキナーゼ活性による解析を行う場合にご使用いただけます。

A. 溶液および試薬

注意:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水または同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS) (#9808)
  2. 10X Cell Lysis Buffer (#9803):20 mM Tris (pH 7.5)、150 mM 塩化ナトリウム、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mM ピロリン酸ナトリウム、1 mM βグリセロリン酸、1 mM Na3VO4、1 μg/mL Leupeptin

    注意:使用前に1 mM PMSF (#8553) を添加することを推奨します*

  1. 3X SDS Sample Buffer (#7722):187.5 mM Tris-HCl (25°CでpH 6.8)、6% w/v SDS、30%グリセロール、150 mM DTT、0.03% w/vブロモフェノールブルー
  2. 10X Kinase Buffer (キナーゼアッセイ用) (#9802):1X Kinase Bufferを1 mL調製する場合は、10X Kinase Buffer 100 µLを精製水 (dH2O) 900 µLに加えて、混ぜ合わせてください。
  3. ATP (10 mM) (キナーゼアッセイ用) (#9804):ATP (200 µM) を0.5 mL調製する場合は、ATP (10 mM) 10 µLを1X Kinase Buffer 490µLに加えてください。

B. 細胞ライセートの調製

  1. 培地を吸引してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 未変性状態で細胞を回収する場合、培地を除去し、氷冷したPBSで細胞を1回洗ってください。
  3. PBSを除去し、各プレート (10 cm) に氷冷した1X Cell Lysis Buffer 0.5 mLを加え、氷上でプレートを5分間インキュベートしてください。
  4. プレートから細胞を掻き取り、遠心分離用チューブに移してください。氷上に保持してください。
  5. 氷上でサンプルを各5秒間、3回超音波処理してください。
  6. 14,000 x g、4°Cで10分間遠心分離して、上清を新しいチューブに移してください。必要に応じて、ライセートは–80°Cで保存することができます。

C. 免疫沈降

  1. 細胞ライセート200 μLに、固相化抗体10 μLを加え、ローテーターを用いて、4°Cで一晩インキュベートしてください。
  2. 4°Cで30秒間、遠心してください。ペレットを1X Cell Lysis Buffer 500 µLで5回洗ってください。洗いの操作は氷上で行ってください。
  3. ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼ活性分析 (セクション D) で解析してください。

D. サンプルの解析

以下のステップから適切な操作に進んでください。

ウェスタンブロッティングで解析する場合

  1. 3X SDS Sample Buffer 20 µLにペレットを再懸濁してください。ボルテックスした後、14,000 x gで30秒間、遠心分離してください。
  2. サンプルを95-100°Cで2-5分間加熱し、14,000 x gで1分間遠心分離してください。
  3. サンプル (15-30 µL) をSDS-PAGEゲル (4–20%) にロードしてください。
  4. サンプルをウェスタンブロット解析してください (ウェスタンブロッティングプロトコールをご覧ください)。

注意:免疫沈降に用いた一次抗体がウェスタンブロットで検出されることがあります。変性IgG重鎖 (およそ50 kDa) によって起こる、目的タンパク質のマスキングを最小化する場合は、Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb (#3677) またはMouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (またはHRP conjugate #5127) の使用を推奨します。変性IgG軽鎖 (およそ25 kDa) によって起こるマスキングを最小化する場合は、Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (またはHRP conjugate #5127) の使用を推奨します。

キナーゼアッセイで解析する場合

  1. ペレットを1X Kinase Buffer 500 µLで2回洗ってください。氷上に保持してください。
  2. 200 µM ATPと適切な基質を添加した1X Kinase Buffer 40 µLでペレットを懸濁してください。
  3. 30°Cで30分間インキュベートしてください。
  4. 3X SDSサンプルバッファー20 µLで反応を停止させます。ボルテックスした後、30秒間遠心分離してください。
  5. リン酸化基質を含む上清を、新しいチューブに移して下さい。
  6. サンプルを95-100°Cで2-5分間加熱し、14,000 x gで1分間遠心分離してください。
  7. サンプル (15-30 µL) をSDS-PAGEゲル (4–20%) にロードしてください。

更新:2007年12月

Protocol Id: 27

特異性 / 感度

AMPKα (23A3) Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate) detects endogenous levels of total AMPKα protein.

Species Reactivity:

ヒト, マウス, Rat, Monkey

使用抗原 / 精製方法

Monoclonal antibody is produced by immunizing animals with a synthetic peptide corresponding to the amino terminus sequence of human AMPKα.

バックグラウンド

AMP-activated protein kinase (AMPK) is highly conserved from yeast to plants and animals and plays a key role in the regulation of energy homeostasis (1). AMPK is a heterotrimeric complex composed of a catalytic α subunit and regulatory β and γ subunits, each of which is encoded by two or three distinct genes (α1, 2; β1, 2; γ1, 2, 3) (2). The kinase is activated by an elevated AMP/ATP ratio due to cellular and environmental stress, such as heat shock, hypoxia, and ischemia (1). The tumor suppressor LKB1, in association with accessory proteins STRAD and MO25, phosphorylates AMPKα at Thr172 in the activation loop, and this phosphorylation is required for AMPK activation (3-5). AMPKα is also phosphorylated at Thr258 and Ser485 (for α1; Ser491 for α2). The upstream kinase and the biological significance of these phosphorylation events have yet to be elucidated (6). The β1 subunit is post-translationally modified by myristoylation and multi-site phosphorylation including Ser24/25, Ser96, Ser101, Ser108, and Ser182 (6,7). Phosphorylation at Ser108 of the β1 subunit seems to be required for the activation of AMPK enzyme, while phosphorylation at Ser24/25 and Ser182 affects AMPK localization (7). Several mutations in AMPKγ subunits have been identified, most of which are located in the putative AMP/ATP binding sites (CBS or Bateman domains). Mutations at these sites lead to reduction of AMPK activity and cause glycogen accumulation in heart or skeletal muscle (1,2). Accumulating evidence indicates that AMPK not only regulates the metabolism of fatty acids and glycogen, but also modulates protein synthesis and cell growth through EF2 and TSC2/mTOR pathways, as well as blood flow via eNOS/nNOS (1).

  1. Hardie, D.G. (2004) J Cell Sci 117, 5479-87.
  2. Carling, D. (2004) Trends Biochem Sci 29, 18-24.
  3. Hawley, S.A. et al. (1996) J Biol Chem 271, 27879-87.
  4. Lizcano, J.M. et al. (2004) EMBO J 23, 833-43.
  5. Shaw, R.J. et al. (2004) Proc Natl Acad Sci U S A 101, 3329-35.
  6. Woods, A. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 28434-28442.
  7. Warden, S.M. et al. (2001) Biochem J. 354, 275-283.

Pathways & Proteins

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研究用のみ。診断手順では使用しません。

Cell Signaling Technology is a trademark of Cell Signaling Technology, Inc.
U.S. Patent No. 7,429,487, foreign equivalents, and child patents deriving therefrom.

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