免疫蛍光染色（凍結組織切片）

A. 溶液および試薬

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

1. 20X Phospate Buffered Saline (PBS)： (9808) To prepare 1L 1X PBS: 20X PBS 50 mLを精製水 (dH₂O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。pHを8.0に調整してください。
2. ホルムアルデヒド：16%, methanol free, Polysciences, Inc. (cat# 18814), use fresh and store opened vials at 4°C in dark, dilute in 1X PBS for use.
3. ブロッキングバッファー：(1X PBS / 5% normal serum / 0.3% Triton™ X-100): 10 mLを用意する場合は、二次抗体の免疫動物と同種の正常血清0.5 mLを加えて (例：Normal Goat Serum (#5425) を9.5 mLの1X PBSに加える) よく混ぜ合わせてください。スターラーで撹拌しながら、Triton™ X-100 30 µLを加えてください。
4. 抗体希釈バッファー：(1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100): 10 mLを用意する場合は、Triton™ X-100 30 µLを1X PBS 10 mLに加えてよく混ぜ合わせてください。混ぜ合わせた後、さらにBSA (#9998) 0.1 gを加えてよく混ぜ合わせてください。

5. 推奨される蛍光標識抗ウサギ二次抗体：

   • Anti-Rabbit IgG (H+L)、 F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4412
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)、 F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4413
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)、 F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 594 Conjugate) #8889
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)、 F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4414

   注意：初めて一次抗体あるいは蛍光標識二次抗体をご使用になる際は、至適希釈率を決めるために抗体のタイトレーションを行ってください。

6. Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#9071)、Prolong^® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)

B. サンプル調製 - 凍結/クライオスタット切片 (IF-F)

1. 固定済み凍結組織切片の場合、免疫染色操作に進んでください (セクションC)。
2. 作製したての未固定の凍結切片の場合は、下記方法で直ちに固定してください。

   1. 1X PBSで希釈した4%ホルムアルデヒドで切片を覆ってください。

      注意：ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフト内でのみ使用してください。

   2. 切片を室温で15分間固定してください。
   3. 固定液を吸引除去し、1X PBSで各5分間、3回すすいでください。
   4. 免疫染色 (セクションC) に進んでください。

C. 免疫染色

注意：特に記載がない限り、下記全てのインキュベーションは室温で行い、乾燥と蛍光色素の退色を防ぐため、湿度の高い遮光箱または蓋付きのディッシュ/プレートに入れてください。

1. ブロッキングバッファーでサンプルを60分間ブロッキングしてください。
2. While blocking, prepare primary antibody by diluting as indicated on protocol on product webpage in Antibody Dilution Buffer.
3. ブロッキング液を吸引除去し、希釈した一次抗体を加えてください。
4. 4℃で一晩インキュベートしてください。
5. 1X PBSで3回、5分間ずつ洗浄してください。
6. 抗体希釈バッファーで希釈した蛍光標識二次抗体を加え、サンプルを暗所、室温で1 - 2時間インキュベートしてください。
7. 1X PBSで3回、5分間ずつ洗浄してください。
8. 切片をProlong^® Gold Antifade Reagent (#9071)、あるいはProlong^® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) とカバーガラスで覆ってください。
9. 最良の結果を得るために、封入剤を室温で一晩硬化させてください。スライドを長期保存する際は、4°C、暗所で、水平にして保存してください。