Cell Signaling Technologyロゴ
特別プロモーション製品を見る>>
1% for the Planetロゴ

12957 Western Blotting Application Solutions Kit Protocol

注意：Please refer to the primary antibody datasheet or product webpage for recommended primary antibody dilution buffer and recommended antibody dilution.

A. 溶液および試薬

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

含まれる試薬

  1. 10X Cell Lysis Buffer：(#9803) To prepare 10 ml of 1X Cell Lysis Buffer: add 1 ml 10X Cell Lysis Buffer to 9 ml dH2O. Chill buffer on ice and add 50 µl 200X PMSF just prior to use.
  2. 200X PMSF: (#8553) Reconstitute 34.84 mg of lyophilized PMSF in 1 ml isopropyl alcohol, to make a 200 mM solution.
  3. 1X SDS Sample Buffer： Blue Loading Buffer Pack (#7722). Prepare fresh 3X reducing loading buffer by adding 1/10 volume 30X DTT (#14265) to 1 volume of 3X SDS loading buffer (#56036). 精製水 (dH2O) で1X に希釈してください。
  4. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)：(#59329)
  5. 10X トリス-グリシンSDS泳動バッファー：(#4050) 1X 泳動バッファー1 Lの調製：add 100 ml 10X Running Buffer to 900 ml dH2O, mix.
  6. 10X トリス-グリシン転写バッファー：(#12539) To prepare 1 L 1X transfer buffer: 10X 転写バッファー100 mLとメタノール200 mLを精製水 (dH2O) 700 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  7. Nitrocellulose Sandwiches: (#12369)
  8. 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST): (#9997) 1X TBST 1 Lの調製：10X TBST 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  9. 脱脂粉乳: (#9999)
  10. ブロッキングバッファー：5% w/v 脱脂粉乳含有1X TBST：150 mLを用意する場合は、脱脂粉乳7.5 gを1X TBST 150 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  11. 洗浄バッファー：1X TBST
  12. ウシ血清アルブミン (BSA) (#9998)
  13. 一次抗体希釈バッファー： 5% w/v BSAあるいは5%脱脂粉乳含有1X TBST (どちらを推奨するかは各製品のデータシートで確認してください)：20 mLを用意する場合は、BSAか脱脂粉乳1.0 gを1X TBST 20 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  14. HRP標識二次抗体：Anti-rabbit (#7074); anti-mouse (#7076).
  15. 検出試薬：SignalFire™ ECL Reagent (#6883). Reagents A (#46935) and B (#74709) should be combined just prior to use.

その他の試薬 (含まれない)

  1. Primary Antibody.
  2. 20X Phospate Buffered Saline (PBS)： (#9808)：1X PBS 1 Lを調製する場合、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  3. Reverse Osmosis Deionized (RODI) Water.
  4. Isopropyl Alcohol.
  5. BCA Protein Assay Kit: (#7780) (OPTIONAL).
  6. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack： (#7727) (OPTIONAL).
  7. Methanol.
  8. 10X Tris Buffered Saline (TBS)： (#12498) 1X TBS 1 L の調製：add 100 ml 10X to 900 ml dH2O, mix. (OPTIONAL).
  9. Streptavidin-HRP: (#3999) (if necessary).

B. タンパク質のブロッティング

最も汎用的なサンプル調製プロトコール

  1. 目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 培養ディッシュから培地を吸引除去し、細胞を1X PBSで洗った後、再度吸引除去してください。If performing protein concentration quantification, proceed to step #3, if not, skip to step #8.
  3. Lyse cells by adding 1X Cell Lysis Buffer (80 µl per well of 6-well plate or 400 µl for a 10 cm diameter plate). Incubate plate on ice for 5 min, then scrape cells off the plate and transfer lysate to a microcentrifuge tube. 氷上に保持してください。
  4. 10-15秒間超音波処理してください。この処理には、細胞を完全に溶解する目的と、DNAを剪断してサンプルの粘性を下げる目的があります。氷上に保持してください。
  5. Centrifuge extract for 10 min at 14,000 x g in a cold microcentrifuge. Transfer supernatant to a new tube and discard pellet.
  6. Determine protein concentration using BCA Protein Assay Kit #7780.
  7. Add 3X SDS Sample Buffer to a final concentration of 1X. Proceed to step #10.
  8. Lyse cells by adding 1X SDS sample buffer (100 µl per well of 6-well plate or 500 µl for a 10 cm diameter plate). 直ちにプレートから細胞を掻き取り、抽出物を遠心分離チューブに移してください。氷上に保持してください。
  9. 10-15秒間超音波処理してください。この処理には、細胞を完全に溶解する目的と、DNAを剪断してサンプルの粘性を下げる目的があります。氷上に保持してください。
  10. サンプル20 µLを95-100℃で5分間加熱処理後、氷上で冷却してください。
  11. 5分間遠心分離してください。
  12. Prepare electrophoresis gel and apparatus using 1X running buffer.
  13. SDS-PAGEゲル (10 cm × 10 cm) に15 µLをアプライし、電気泳動してください。

    注意：電気泳動確認用のプレステイン分子量マーカー (#59329、5 µL/lane) および分子量測定用のビオチン化プロテインラダー (#81851、10 µL/lane) も同時に電気泳動することをお勧めしています。

  14. Perform electrotransfer to nitrocellulose membrane (#12369) using 1X transfer buffer in a tank (wet) transfer system.

C. 転写膜のブロッキングと抗体反応

注意：Volumes are for 10 cm x 10 cm (100 cm2) or smaller membrane; for larger membranes, adjust volumes accordingly.

I. 転写膜のブロッキング

  1. オプション：転写後、転写膜を室温で5分間、TBS 25 mLで洗浄してください。
  2. 転写膜を室温で1時間、ブロッキングバッファー25 mL中でインキュベートしてください。
  3. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。

II. 一次抗体反応

使用される一次抗体に応じて、適切な下記手順へ進んでください。

非標識一次抗体の場合

  1. 一次抗体液10 mL (製品データシートに記載されている希釈バッファー、希釈率をもとに適切に調製してください) 中で転写膜を静かに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  3. Incubate membrane with the species appropriate HRP-conjugated secondary antibody (#7074 or #7076 at 1:2000) and, if necessary, anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075 at 1:1000–1:3000) to detect biotinylated protein markers in 10 ml of blocking buffer with gentle agitation for 1 hr at room temperature.
  4. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  5. 検出操作へ進んでください (セクションD)。

HRP標識一次抗体の場合

  1. 一次抗体反応液10 mL (製品データシートに記載されている希釈バッファー、希釈率をもとに適切に調製してください) 中で転写膜を静かに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  3. If necessary, incubate with Anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075 at 1:1000–1:3000), to detect biotinylated protein markers, in 10 ml of blocking buffer with gentle agitation for 1 hr at room temperature.
  4. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  5. 検出操作へ進んでください (セクションD)。

ビオチン標識一次抗体の場合

  1. 一次抗体反応液10 mL (製品データシートに記載されている希釈バッファー、希釈率をもとに適切に調製してください) 中で転写膜を静かに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  3. Incubate membrane with Streptavidin-HRP (#3999, not supplied) at 1:2000 in 10 ml of blocking buffer with gentle agitation for 1 hr at room temperature.
  4. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  5. 検出操作へ進んでください (セクションD)。

    6. Do not add Anti-biotin, HRP-linked Antibody for detection of biotinylated protein markers. HRP標識抗ビオチン抗体は必要ありません。Streptavidin-HRPでビオチン化マーカーも検出できます。

D. タンパク質の検出

  1. Incubate membrane in 10 ml SignalFire™ #6883 (5 ml Reagent A (#46935), 5 ml Reagent B (#74709)) with gentle agitation for 1 min at room temperature.
  2. 転写膜の余分な液を除去し (この時、乾燥させないようにご注意ください)、ラップで包んでX線フィルムに露光してください。初回10秒間の露光結果により、適度な露光時間が予測できます。

    注意：Due to the kinetics of the detection reaction, signal is most intense immediately after incubation.