免疫蛍光染色 (免疫細胞染色)

A. 溶液および試薬

効率的でお得な調製済み試薬が入った#12727 Immunofluorescence Application Solutions Kitを使用して、質の高い免疫蛍光染色画像データを取得しましょう。

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

1. 20X Phospate Buffered Saline (PBS)： (9808) To prepare 1L 1X PBS: 20X PBS 50 mLを精製水 (dH₂O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。pHを8.0に調整してください。
2. ホルムアルデヒド：16%, methanol free, Polysciences, Inc. (cat# 18814), use fresh and store opened vials at 4°C in dark, dilute in 1X PBS for use.
3. ブロッキングバッファー (1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100)：10 mLを用意する場合は、二次抗体の免疫動物と同じ動物種の正常血清0.5 mL (例：Normal Goat Serum (#5425)) と20X PBS 0.5 mLを精製水 (dH₂O) 9.0 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。スターラーで撹拌しながら、Triton™ X-100 30 µLを加えてください。
4. 抗体希釈バッファー (1X PBS/1% BSA/ 0.3% TritonX-100)：10 mLを用意する場合は、Triton™ X-100 30 µLを1X PBS 10 mLに加えてよく混ぜ合わせてください。混ぜ合わせた後、BSA (9998​) 0.1 gを加えてよく混ぜ合わせてください。

5. 推奨される蛍光標識抗ウサギ二次抗体：

   • Anti-Rabbit IgG (H+L)、 F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4412
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)、 F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4413
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)、 F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 594 Conjugate) #8889
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)、 F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4414
6. Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#9071)、Prolong^® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)

B. 試料作製 - 培養細胞株 (IF-IC)

注意：マルチウェルプレート、チェンバースライドあるいはカバーガラス上で直接細胞を培養、薬剤処理、固定および染色してください。

1. 溶液を吸引除去し、細胞が2 - 3 mm浸る程の4%ホルムアルデヒド (1X PBSで希釈) を加えてください。

   注意：ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフト内でのみ使用してください。

2. 細胞を室温で15分間固定してください。
3. 固定液を吸引除去し、1X PBSで各5分間、3回すすいでください。
4. 免疫染色 (セクションC) に進んでください。

C. 免疫染色

注意：特に記載がない限り、下記全てのインキュベーションは室温で行い、乾燥と蛍光色素の退色を防ぐため、湿度の高い遮光箱または蓋付きのディッシュ/プレートに入れてください。

1. ブロッキングバッファーでサンプルを60分間ブロッキングしてください。
2. While blocking, prepare primary antibody by diluting as indicated on product webpage in Antibody Dilution Buffer.
3. ブロッキング液を吸引除去し、希釈した一次抗体を加えてください。
4. 4℃で一晩インキュベートしてください。
5. 1X PBSで3回、5分間ずつ洗浄してください。
6. 抗体希釈バッファーで希釈した蛍光標識二次抗体を加え、サンプルを暗所、室温で1 - 2時間インキュベートしてください。
7. 1X PBSで3回、5分間ずつ洗浄してください。
8. 切片をProlong^® Gold Antifade Reagent (#9071)、あるいはProlong^® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) とカバーガラスで覆ってください。
9. 最良の結果を得るために、封入剤を室温で一晩硬化させてください。スライドを長期保存する際は、4°C、暗所で、水平にして保存してください。