免疫組織化学染色プロトコール (パラフィン切片)

A. 溶液および試薬

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

1. キシレン
2. エタノール、無水変性、病理学グレード (100%および95%)
3. 脱イオン水 (dH₂O)
4. ヘマトキシリン (オプション)
5. 洗浄バッファー：
   1. 1X Tris Buffered Saline with Tween^® 20 (TBST): To prepare 1L 1X TBST add 100 ml 10X Tris Buffered Saline with Tween^® 20 (#9997) to 900 ml dH₂0, mix.
6. SignalStain^® Antibody Diluent (#8112)
7. 1X クエン酸賦活化液：To prepare 250 mL of 1X citrate unmasking solution, dilute 25 ml of SignalStain^® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) with 225 mL of dH₂O.
8. 3%過酸化水素：100 mLを用意する場合は、30%過酸化水素水 (H₂O₂) 10 mLを精製水 (dH₂O) 90 mLに加えてください。
9. ブロッキング液：TBST/5% Normal Goat Serum or 1X Animal-Free Blocking Solution.
   1. TBST/5% Normal Goat Serum: to 5 ml 1X TBST, add 250 µl Normal Goat Serum (#5425).
   2. 1X Animal-Free Blocking Solution: to 4 mL of dH₂O add 1 ml of Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019).
10. 検出システム：SignalStain^® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Rabbit #8114).
11. 基質：SignalStain^® DAB Substrate Kit (#8059)
12. Hematoxylin: Hematoxylin #14166
13. Mounting Medium: SignalStain^® Mounting Medium #84583

B. 脱パラフィン/再水和

注意：操作の間は、スライドを乾燥さないようにご注意ください。

1. 切片の脱パラフィン/水和：
   1. キシレンで切片を各5分間、3回インキュベートしてください。
   2. 100%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
   3. 95%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
2. 精製水 (dH₂O) で切片を各5分間、2回洗浄してください。

C. 抗原賦活化

クエン酸の場合：Heat slides in a microwave submersed in 1X citrate unmasking solution until boiling is initiated; follow with 10 min at a sub-boiling temperature (95°-98°C). スライドを実験台で30分間冷却してください。

D. 染色

1. 精製水 (dH₂O) で切片を各5分間、3回洗浄してください。
2. 3%過酸化水素で切片を10分間インキュベートしてください。
3. 精製水 (dH₂O) で切片を各5分間、2回洗浄してください。
4. 洗浄バッファーで切片を5分間洗浄してください。
5. ブロッキング液100​-400 μLで各切片を室温で1時間ブロッキングしてください。
6. ブロッキング液を除去し、SignalStain^®​ Antibody Diluent (#8112) で希釈した一次抗体100-400 μLを各切片に加えてください。4℃で一晩インキュベートしてください。
7. SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114​) を室温に戻してください。
8. 抗体液を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗浄してください。
9. 1-3滴のSignalStain^® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114) で切片を覆ってください。加湿チャンバー内 (室温) で30分間インキュベートしてください。
10. 洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗浄してください。
11. 使用前にSignalStain^® DAB Chromogen Concentrate 1滴 (30 µL) をSignalStain^® DAB Diluent 1 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
12. 調製したSignalStain^® DAB溶液 100-400 µLを各切片に加え、注意深く観察してください。通常は1-10分間で十分な染色強度が得られます。
13. スライドを精製水 (dH₂O) に浸してください。
14. 必要に応じて、Hematoxylin (#14166) で切片を対比染色してください。
15. 精製水 (dH₂O) で切片を各5分間、2回洗浄してください。
16. 切片を脱水してください：
    1. 95%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    3. キシレンで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
17. カバーガラスとMounting Medium (#84583) で切片を封入してください。

注意：Use of detection reagents other than those specified in this protocol may require further optimization of the primary antibody to account for the different sensitivities of the detection reagents.